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基因測序技術總結

Peng_001已關注

62020.05.17 17:37:21字數 3,646閱讀 1,701

參考:?從零開始完整學習全基因組測序數據分析：第1節 測序技術

作者：堿基礦工
參考：【陳巍學基因】視頻1：Illumina測序化學原理

前言

什么是全基因組測序？

全基因組測序，英文為Whole Genome Sequencing，簡稱WGS，指的是把物種細胞里面完整的基因序列，從第一個DNA開始，一直到最后一個DNA，完完整整地檢測出來，并排列好。

全基因測序的意義？

全基因測序，理論上可以得出基因組上任何類型的突變。包含了所有基因與其的生命特征的關聯信息。

測序技術

第一代測序技術

第一代DNA測序技術用的是1975年由桑格（Sanger）和考爾森（Coulson）開創的鏈終止法。（Sanger 法）
世界上第一個全基因序列（噬菌體phiX-174），就是由桑格在1977年完成的。

原理

huangshujia博客園

第一代測序技術主要借助于ddNTP（NTP 包含了ATCG四種類型），這是一種具有熒光標記的核酸，且2’和3’都不含羥基，因此在DNA合成過程中無法形成磷酸二酯鍵，當核酸序列連接ddNTP后，就會中斷連接。
因此，如圖顯示，在DNA 合成反應體系中，分四組加入一定比例的四種ddNTP，在遇到對應位置的ddNTP時，反應就會終止。在不同的組別下會形成不同長度的核酸序列。
由于使用的ddNTP具備熒光標記，接著使用凝膠電泳與顯影技術，便可以得到電泳的條帶。根據不同組別不同條帶終止的位置，就可以讀出對應條帶下對應組別（A,T,C,G）的堿基信息。從而實現測序。
至于說為什么不同組別（A,T,C,G）內的DNA 可以生成不同的條帶，因為所有的核酸，與某一種特定的ddNTP，與對于位置的上一條核酸結合的概率是相同且隨機的。因此在大量的核酸與引物下，可以合成所有ddNTP 可能結合的部位，而結合該部位的ddNTP 則通過條帶顯示出來。

優點&缺點

優點：測序準確率高，高達99%。
缺點：通量低，成本高。

其他基于相同原理的，還有焦磷酸測序法、連接酶法等。

第二代測序技術（NGS）

我們一般說的NGS（Next Generation Sequencing），或高通量測序技術，都是指第二代測序技術。
按照上面說的一代測序特點，顯然是難以進行大規模使用的，也因此并不是一個理想的大規模測序方法。

• （要是用一代測序，做人類基因組計劃的方法，需要多久呀？！以前完成一個人類基因組的測序需要3年時間，而使用二代測序技術則僅僅需要1周）

Roche公司的454技術與illumina公司的Solexa/Hiseq技術和ABI公司的SOLID技術的出現，標志著NGS 的誕生。

原理

目前主流的NGS 測序，采用illumina 技術。主要采用一種邊合成邊測序的方法。除此之外，NGS 的特點還有其序列讀長方面短很多。

1）構建DNA測序文庫

使用超聲波，將一堆DNA分子用超聲波打斷成一定長度范圍的小片段。一般來說，基本都是打斷為300bp-800bp長的序列片段，在兩頭用酶補平。接著在3'端用Klenow 酶加上一個A堿基，然后再用連接酶在小片段A堿基后面加上一段DNA序列（接頭）。構建出單鏈DNA文庫，備用。

2）流動槽（flowcell）吸附

flowcell 是用于吸附流動DNA 的槽道，是測序的反應容器。flowcell 一般由八個槽道構成，被稱為lane。每個lane 的表面被設計成有很多的接頭，而這些接頭則可以和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭配對。通常來說lane 上的接頭為兩種引物，正好配對DNA片段兩頭添加的接頭。
而lane 上的接頭，一般也是通過共價鍵的方式連到flowcell 上。因為后面的步驟會有大量液體流過flowcell，為避免引物被沖掉。
需要??的是，這里lane 的引物一般被設計為一頭與DNA 一端互補，一頭與DNA 另一端一致。

lane 上的引物

當第一步文庫構建完成后，文庫中的DNA 在通過flowcell 的時候便會與lane 上的接頭配對，并隨機吸附在槽道的表面。
理論上lane 之間不會有相互的影響。

3）橋式PCR擴增與變性

本質是將文庫種到flowcell 上并進行擴增的過程。
因為文庫兩頭添加的DNA序列與lane 上的接頭是互補的，所以當二者結合會產生互補雜交。

將文庫加入到flowcell 上。會進行以下步驟。

1.雜交結合。

文庫會與表面的引物結合，互補雜交。

2.合成互補鏈。

雜交后，會往其中加入dNTP 與聚合酶，聚合酶會從引物起始位置開始，合成文庫的互補鏈。

3.解鏈。

加入NaOH 堿性溶液，DNA 雙鏈此時會發生解鏈。而此時的模版鏈（文庫），也就是沒有與引物結合的鏈，就被沖走了。

4.重連接。

通過加入中性溶液，緩沖堿性液體。此時引物上的互補鏈便會和引物上的另外一個引物發生雜交。ps：此時的DNA 片段為測序DNA 片段的互補鏈。

5.再合成。

再次雜交后，再一次引入dNTP 與聚合酶，以原先的互補鏈為模版，再次合成出一條新的互補鏈。

6.再解鏈。

再次加入堿溶液，這時兩條鏈又會解離開。而由于此時兩根鏈都是公價連接在lane 上，并不會被沖刷走。

7.循環4-6

再次加入中性溶液，兩根鏈又會和其他鏈雜交。

再次加入酶和dNTP，又會合成。

再次加入堿， 又會分離。循環下去，2**n 指數方式增長lane內合成的DNA鏈。

• 一個個的DNA雙鏈，是不是和橋一樣？

8.拆解雙鏈

完成了橋式PCR 的擴增后，需要將合成的雙鏈，拆分成可以測序的單鏈。理論上說，是通過化學方法，將一個引物（與lane 連接的接頭）上的特定基團切掉，此時再用堿溶液來清洗該芯片。此時堿便可以讓其中切除基團的DNA鏈沖刷掉。

9.連接測序引物

再次加入中性溶液緩沖。并在中性溶液內加入測序引物。接下來就是測序工作了。

4）測序

1.合成測序鏈

加入帶熒光標記的dNTP，且3' 末端被疊氮基堵住。（與Sanger的有點像呢）并加入聚合酶。由于3' 末端被堵住了，所以一個循環只能延長一個堿基。

合成完成后，就用水把多余的dNTP 和酶沖掉。

2.測定堿基類型

放到顯微鏡下進行激光掃描。因為使用的dNTP，事先已經被熒光標記了，便可以根據其發出來的熒光，判斷其堿基類型。由于新合成的堿基與模版鏈堿基互補，便可反推出模版上的基因類型。

3.切除疊氮基團

完成上面的循環后，接著加入一些化學試劑，把4.1 步中dNTP上的疊氮基團與熒光標記基團切除。此時3' 的羥基暴露出來，便可以繼續連接新的dNTP。

4.循環1-3

不斷重復加堵住3' 的熒光標記的堿基-測定堿基類型-切除標記...過程。重復上百次。

5.讀取Index(Barcode)

測得了DNA序列，由于二代測序技術首先是將DNA打斷為小片段的，因此便需要判斷出測定結果的來源。
文庫的接頭上，在開始時1）做了一些標記，每一個樣本有其特定的接頭，每個接頭里有一個特定的序列。這段特定的序列，便是index，或barcode。標記了樣本的來源。

首先用堿將測完的序列（稱為“read1”序列）解鏈洗脫掉。

接著加入中性液緩沖，然后加入新的測序引物（“read2”序列）。
一般來說，read2測序引物的結合位點，正好在index 序列的旁邊。

接下來進行第二輪測序。一般是讀6-8個堿基（方法同先前的4.4中的循環）。根據讀出來的堿基，便可以判斷出它來自于哪個原始樣本。

雙端測序技術

illumina 測序還應用了雙端測序技術。允許從正向和反向讀取DNA鏈，便將illumina 測序的有效長度加了一倍。
除此之外，flowcell 上的8個lane 上，可以有上億個點提供DNA鏈的合成，每個類型（來源）的DNA鏈可以形成一個cluster，而每一個cluster，都是由一樣的DNA 鏈構成。
而上億個彼此不同的cluster，便實現了很高的測序數據量。（同時對不同的DNA序列進行上述1-4步驟）

優點&缺點

優點：高通量，成本低。
缺點：錯誤率相比Sanger 法高，主要來源是堿基替換過程可能會出錯。（4.1 合成測序鏈）

• 不同測序儀比較

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第三代測序技術

第三代測序，最大的特點就是實現了單分子測序，因此也被叫做單分子測序。以以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測序為代表。
而正因其是單分子測序，因此測序過程也無需進行PCR擴增，可以實現超長讀長。

PacBio SMRT 測序原理

SMRT 本質也是采用了邊合成邊測序的思想，以SMRT 芯片（flowcell）為載體進行測序。
首先在flowcell 中添加聚合酶和熒光標記的dNTP。而在堿基配對結合時，SMRT芯片 會利用ZMW（零模波導孔）原理 將反應信號與周圍堿基的熒光背景區分，并捕獲配對的堿基信號，根據該信號（光的波長與峰值）判斷堿基類型。
SMRT 測序中，DNA聚合酶是實現超長讀取測序信息的關鍵。酶的活性越強，其合成時間越長，能夠讀取到的DNA片段信息就越長。而用于檢測的激光則會對酶造成一定的損傷。

零模波導孔原理

在一個SMRT芯片反應管中（SMRTcell），有許多圓形納米小孔，外徑100多納米，小于幾百納米的檢測光的波長。因此能量并不會輻射到周圍，而是保持直線狀態，起到了保護的作用。
正因此，檢測激光從底部打入SMRTcell 后不會穿透小孔進入上方的溶液區，能量會被限制在一個小范圍，正好足夠覆蓋需要檢測的部分。
而信號僅僅只是來自于這個小反應區域，孔外背景中其他的dNTP 依然在黑暗中，從而實現降低背景噪音的目的。

甲基化檢測

SMRT 技術不僅能夠通過信號進行單分子測序，還可以通過檢測相鄰堿基的測序時間，從而判斷出堿基的表觀修飾情況，如甲基化等。
若堿基存在甲基化修飾，則其通過DNA 聚合酶的時間會延長，信號中相鄰兩峰之間的距離會增大，因此可以借助該時間差異進行判斷。

優點&缺點

優點：快！檢測速度可達到 10 dNTP/s。單分子測序，超長讀取。
缺點：錯誤率高（單分子測序通病），可達到10%-15%，主要是序列缺失及錯位。但可以通過多次測序進行彌補。

Oxford Nanopore 測序技術

由Oxford Nanopore 研發的MinION，由于精巧的體積，被俗稱為U盤測序儀。

測序原理

與其他測序技術，包括一代、二代及SMRT 測序技術都不相同的是，minION 采用了電信號技術而非光信號對堿基進行測序。
該測序儀中有一種特殊的納米孔，而孔內則共價結合了分子接頭。
當DNA分子通過納米孔時，這些分子使納米孔內的電荷發生變化，從而短暫的影響流過納米孔的電荷強度。
而不同堿基所影響電流的幅度又是有差異的，通過高靈敏度的檢測設備，可以檢測到這些細微變化，從而堅定出通過的堿基類型。

甲基化檢測

和SWRT 芯片一樣，minION 也可以讀出甲基化的胞嘧啶。

優點&缺點

優點：讀長更長，甚至優于SMRT，在幾十到上百kb，甚至可以達到900kb。數據可以實時讀取，且起始DNA 在測序中不會被破壞。
缺點：依舊是錯誤率高。

總結

以上是生活随笔為你收集整理的基因测序技术总结的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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