本文來自 sixu_9days 的CSDN 博客 ：https://blog.csdn.net/sixu_9days/article/details/78948914

illumina測序的核心在于利用可逆終止的、熒光標記的dNTP進行邊合成邊測序（Sequencing-By-Synthesis,SBS）

Flowcell（流動池）是有著2個或8個lane（泳道）的玻璃板，每個lane可以測一個樣本或者多樣本的混合物，且隨機布滿了能夠與文庫兩端接頭分別互補配對或一致的寡核苷酸（oligos，P7和P5接頭）。一個lane包含兩列，每一列有60個tile，每個tile會種下不同的cluster，每個tile在一次循環中會拍照4次（每個堿基一次）。

一、Library Preparation文庫的構建

1. 利用轉座子（transposome）對雙鏈DNA進行剪切以及接頭（adapter）的連接

?

2. 接頭連接成功后，利用低循環擴增技術在接頭處進行修飾，分別在兩端添加sequencing primer binding site1 / sequencing primer binding site2（即測序引物結合位點）、index1/index2以及我們稱之P5和P7的寡核苷酸序列

下圖是維基百科的示意圖，詳細一些。

注意：

P5和P7是不同的，它們分別和flowcell上的接頭互補和相同。為了方便闡述，將與P5互補的接頭稱為P5’，與P7互補的接頭稱為P7’。

index1和index2也是不同的，與P5相連的是index2，與P7相連的是index1

關于index，也叫barcodes，因為一個lane可以同時測多個樣品，為了避免混淆樣品的read products，每種樣品的DNA由一種index修飾，這樣測序得到的reads都是具有index標記的，在測序結果中，依據之前標簽與樣品的對應關系，就可以獲得對應樣品的數據。而這里的index1和index2是為了區分paired-end測序得到的雙端reads。

二、Cluster generation 簇生成

1. Flowcell上隨機分布了兩種不同的寡核苷酸序列，分別與P5互補（即P5’），與P7一致（即P7）。

2. 待測sequence通過P5與folwcell上的P5’序列雜交互補，以待測sequence為模板進行互補鏈（即reverse strand）的延伸，互補鏈的兩端為P5’和P7’。

3.? 接下來模板鏈被切斷并洗下

Reverse strand的P7’與Flowcell上的P7雜交互補，進行鏈的合成，這就是我們所熟知的橋式PCR

接下來合成的雙鏈被解鏈，再分別與Flowcell上的接頭雜交互補，延伸，解鏈，雜交，延伸，解鏈...如此重復35個循環

4. 橋式PCR完成后，使用NAOH將雙鏈解鏈，并利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）對8-氧鳥嘌呤糖苷（8-oxo-G）的選擇性切斷作用，選擇性地將P5’與鏈的連接切斷，留下與Flowcell上P7連接的鏈，也就是Forward strand。同時游離的3’端被阻斷，防止不必要的DNA延伸

三、測序

1. 測序引物（sequencing primer）結合到靠近P5的測序引物結合位點1（sequencing primer binding site 1）上，在系統中加入四種dNTP和DNA聚合酶。這里的dNTP有兩個特點：它是有熒光基團標記的，每種堿基標記的熒光基團不一樣；它的3’末端連了一個疊氮基，這個疊氮基能夠阻斷后面的堿基與它相連

因此在聚合酶的作用下，與Forward strand相應位置堿基配對的dNTP就會結合到新合成的鏈上，而由于疊氮基的存在，后面的dNTP無法繼續連接。這時用水將剩余的dNTP和酶給沖掉，將Flowcell進行掃描，掃描出來的熒光對應的堿基的配對堿基即是該鏈該位置的堿基。同時在這個Flowcell上有成千上萬個cluster也在進行同樣的反應，因此一個循環就能同時檢測多個樣本（這也是高通量的核心所在）。這個循環完成后，加入化學試劑把疊氮基和標記的熒光基團切掉，進行下一個循環（堿基的連接、檢測與切除）。如此重復直至所有鏈的堿基序列被檢測出，也就是Forward read 序列。

2. Index測序：所有循環結束后，read products 被洗掉，index1 primer與鏈上index primer1 結合位點雜交配對，進行index1的合成及檢測

3. Index1測序完成后，洗脫測序產物。此時機器已通過熒光得到了index1的序列

4.Index2測序：Forward strand頂端的P5序列與Flowcell上的P5’雜交配對，進行index2測序。測序完成后洗脫產物

四、Paried-end sequencing（即對Reverse strand測序）

1. 洗脫index2測序產物后，以Flowcell上的P5’為引物，Forward strand為模板進行橋式擴增，得到雙鏈

2. NAOH使雙鏈變性為單鏈，并洗去已經測序完成的Forward strand

3.? ?類似的，readprimer2結合到靠近P7’的read primer binding site 2開始對Reverse strand的測序。測序完成后即可得到Reverse read序列。

前面介紹的都是paired-end的測序，而single-end測序方式是只將index，sequencing primer binding site以及P7/P5添加到 fragamented DNA片段的一端，另一端直接連上P5/P7，將片段固定在Flowcell上橋式PCR生成DNA簇，然后單端測序讀取序列

illumina的官方視頻：

http://v.youku.com/v_show/id_XMTI1MjA5Mzg5Mg==.html?spm=a2h0k.8191407.0.0&from=s1.8-1-1.2

總結

以上是生活随笔為你收集整理的illumina 双端测序（pair end）的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

如果覺得生活随笔網站內容還不錯，歡迎將生活随笔推薦給好友。