第 11-12 講 基因功能研究技術(shù)

文章目錄

• 8. 基因功能研究技術(shù)
• • 8.1 基因活性的操控技術(shù)
  • • 8.1.1 過表達 (overexpression)
    • 8.1.2 基因定點突變 (site-directed mutagenessis) 技術(shù)
    • 8.1.3 RNAi 技術(shù)
    • 8.1.4 基因敲除 (gene knock-out) 技術(shù)
  • 8.2 基因表達檢測技術(shù)
  • • 8.2.1 第一代測序技術(shù) Sanger dideoxy sequencing
    • 8.2.2 第二代測序技術(shù)
    • • 8.2.2.1 Roche / 454 : Genome Sequencer FLX
      • 8.2.2.2 lllumina Solexa cyclical base addition
      • 8.2.2.3 ABI SOLiD sequencing by ligation （用得不多）
    • 8.2.3 第三代測序：單分子測序技術(shù)
  • 8.3 功能調(diào)控與檢測技術(shù)（沒講）
  • • 8.3.1 表達量
    • 8.3.2 酵母單雜、雙雜交系統(tǒng)
    • 8.3.3 各類相互作用技術(shù)
    • 8.3.4 標記和熒光成像技術(shù)

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8. 基因功能研究技術(shù)

8.1 基因活性的操控技術(shù)

可以過表達、全部或部分抑制基因的表達，通過觀察靶基因過表達或者缺失后生物體的表型變化研究基因功能。

8.1.1 過表達 (overexpression)

• 重組 DNA 技術(shù) (Recombinant DNA technology)：顯性陰性蛋白
• 蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)往往是與其他蛋白質(zhì)分步裝配形成復合物，一起發(fā)揮作用。如果只是過表達其中一個蛋白，可能只是影響復合物的裝配，而不影響復合物功能；但如果過表達蛋白質(zhì)的突變體（利用重組 DNA 技術(shù)，Recombinant DNA technology ），很可能影響整個復合物的功能。
  

8.1.2 基因定點突變 (site-directed mutagenessis) 技術(shù)

• 基因定點突變 (site-directed mutagenessis, in vitro)：通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個（些）氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造 DNA 調(diào)控元件特征序列、修飾表達載體、引入新的酶切位點等。

聚合酶鏈反應 (PCR) 的應用

(1) 亞克隆 (Subcloning DNA targets using PCR)

• T/A 克隆
• 在引物中加限制性內(nèi)切酶位點
• 平端連接 (Blunt-end Ligation)

◆ 使用 PCR 亞克隆 DNA 靶標

◆ 在引物中加入限制性內(nèi)切酶酶切位點，PCR 擴增后酶切得到粘性末端，連接到載體中去。

(2) 產(chǎn)生 DNA 探針 （兩種方法）

• 直接合成（試劑公司）
• 通過 PCR 產(chǎn)生單鏈 DNA 探針：控制上下游引物的比例，原理類似 TAIL-PCR。
  
• PCR 產(chǎn)生用于體外轉(zhuǎn)錄的模板：在不配對區(qū)設計引物，在引物中加入 T7 promoter 序列（即測序引物），使 PCR 產(chǎn)物含有 T7 promoter，可以用來轉(zhuǎn)錄得到 RNA。
  

(3) PCR 的診斷應用

• 使用基因組特異性引物對檢測病原體
• 篩選未知突變的特定基因
• 使用已知的 STS 標記進行基因分型

PCR 介導的定點突變 (重疊延伸法) PCR-mediated in vitro mutagenesis

• 目的：將圖中的 AA/TT 突變?yōu)?CC/GG
• 方法：設計 重疊互補引物。
  ① 用上游引物 P1 和下游帶有 GG 突變的引物 P2 擴增得到帶突變位點 CC 及上游序列 的 DNA 片段；
  ② 用上游帶 CC 突變的引物 P3 和下游引物 P4 擴增得到帶突變位點 GG 及下游序列的 DNA 片段；（P3 與 P2 引物有重疊區(qū)）
  ③ 將兩個 PCR 產(chǎn)物混合，進行 PCR 延伸，此時只有 5’-3’方向可以延伸。
  ④ 以延伸反應產(chǎn)物為模板，以 P1/P4 為引物擴增，得到最終產(chǎn)物。
• 重疊延伸 PCR 技術(shù) (SOE PCR) 是指在 PCR 技術(shù)的基礎上，采用 具有互補末端的引物，使 PCR 產(chǎn)物形成重疊鏈，通過重疊鏈的延伸，將不同來源的片段重疊拼接起來的一項新技術(shù)。該技術(shù)可以很快獲得其他依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物，其成功的關鍵是重疊互補引物的設計。SOE PCR 在基因的定點突變、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有著獨特的應用。
• 原理：在重疊延伸 PCR 中，兩個重疊的 DNA 片段是分別從兩個獨立的 PCR 擴增反應得到的。預設突變構(gòu)建在重疊區(qū)域，存在于兩個擴增片段中。設計 4 種引物，用第一對引物擴增含有突變位點及其上游序列的 DNA 片段，第二對引物被用來擴增含突變位點及其下游序列的 DNA 片段，兩個側(cè)翼引物含野生型序列，兩個突變引物含有希望引進的突變位點，如置換插入或缺失。混合兩次 PCR 的產(chǎn)物，由于兩個突變引物有重疊區(qū)，重疊片段之間退火，延伸成異源雙鏈，加入外側(cè)引物進行第三次 PCR，即可得到目標突變體。
• 參考資料：
  重疊延伸 PCR
  利用重疊延伸 PCR 技術(shù)進行 DNA 的人工合成

多位點突變反應 (MMR) 策略

• 設計兩對突變引物，突變位點設計在引物（MP1/MP2）中，進行兩個不同的擴增，擴增產(chǎn)物上下游各有一個缺口，連接缺口，再進行第二輪擴增。
• 選擇擴增的酶比較重要，應不具有 3’-5’外切酶活性，使 PCR 擴增停止在突變位點處產(chǎn)生缺口（只能線性擴增而不能指數(shù)擴增）。

● 重疊延伸介導的定點誘變機制

• 首先將模板 DNA 分別與引物對 1（正向誘變引物 FM 和反向引物 R2) 和引物對 2（正向引物 F2 和反向誘變引物 RM) 退火，通過 PCR1 和 PCR2 擴增出兩種靶基因片段。
• FMR2 和 RMF2 片段在重疊區(qū)發(fā)生退火，用 DNA 聚合酶補平缺口，形成全長雙鏈 DNA, 進行 PCR3 擴增。
• 最后，用引物 F2 和 R2 擴增出帶有突變位點的全長 DNA 片段 (PCR4)。

● 大引物誘變法

• 首先用正向突變引物 (M) 和反向引物 (R1), 擴增模板 DNA 產(chǎn)生雙鏈大引物 (PCR1), 與野生型 DNA 分子混合后退火并使之復性。
• 第二輪 PCR2 中加入正向引物 (F2), 與 PCR1 中產(chǎn)生的一條互補鏈配對，擴增產(chǎn)生帶有突變的雙鏈 DNA。
• 由于 P2 的退火溫度顯著高于第一輪 PCR 所使用的引物 M 和 R1, 因此，可以忽略引物 M 和 R1 在本輪反應中所造成的干擾。獲得定點突變 PCR 產(chǎn)物以后，一般需進行 DNA 序列分析以驗證突變位點。

● 參考文獻：改進的多片段重疊延伸 PCR 制作基因多位點突變
采用重疊延伸 PCR（overlap extension PCR，OE-PCR） 法：第一輪 PCR 擴增出三個片段，第二輪 PCR 同時利用三片段重疊延伸產(chǎn)物作為模板擴增出目標基因突變體，再按常規(guī)分子克隆方法將其連入質(zhì)粒載體。

PCR 介導的缺失突變

• 目的：使基因片段中產(chǎn)生缺失片段（圖中紅色和紫色之間的 DNA 片段）
• 原理與定點突變類似，利用 OE-PCR 的方法，根據(jù)缺失片段兩側(cè)的序列設計可以反向互補的引物 P2/P3，分別與 P1/P4 擴增，混合延伸，再將延伸產(chǎn)物用 P1/P4 擴增，得到最終產(chǎn)物。

The Polymerase Incomplete Primer Extension (PIPE) 聚合酶不完全引物延伸

• 參考文獻：The Polymerase Incomplete Primer Extension (PIPE) method applied to high-throughput cloning and site-directed mutagenesis [PMID: 18988020]
  使用 PIPE 方法，所有主要的克隆操作均通過在擴增后立即用 PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞來實現(xiàn)。普通的 PCR 會產(chǎn)生不完全延伸產(chǎn)物的混合物。使用簡單的引物設計規(guī)則和 PCR，在這些不完全延伸混合物的末端引入短的重疊序列，使互補鏈退火產(chǎn)生雜交的載體/插入序列雜交體。這些雜交體在沒有任何 PCR 后的酶促操作的情況下直接轉(zhuǎn)化為受體細胞。

• 利用 PIPE 進行克隆，在載體中插入一個外源基因（A.B）/ 突變 (C.)
  

• PIPE 方法中使用的（A.B.C）三種常見 PCR 擴增的寡核苷酸設計，每個引物 5 '末端的前 15 個堿基被設計成互補序列。
  A. V-PIPE (vector PCR)：引物 1 和 2 可用于擴增載體，例如 SpeedET。
  B. I-PIPE（插入 PCR)：引物 3 和 4 可以用于擴增來自不同模板的插入片段（目的片段）。
  P1 與 P3 ，P2 與 P4 的 5’端有 15 個堿基的反向互補序列（overlap），因此目的片段可以與載體重組相連 。
  C. M-PIPE（突變 PCR)：引物 5 和 6 可用于產(chǎn)生點突變。引物 7 和 8 可用于構(gòu)建缺失突變體。引物 9 和引物 10 可用于構(gòu)建插入突變體。

• 參考文獻：基于 PIPE 現(xiàn)象的質(zhì)粒克隆位點序列設計與功能評價

8.1.3 RNAi 技術(shù)

• RNAi (RNA interference, RNA 干擾）技術(shù)：利用雙鏈 miRNA 高效、特異性降解細胞內(nèi)同源 mRNA 從而阻斷靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。RNAi 的命名來源于安德魯·法爾。

• 雙鏈 miRNA 是 RNAi 的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補的單鏈 RNA (ssRNA, single-stranded RNA）的降解。細胞核中 DNA 轉(zhuǎn)錄出 pre-miRNA，加工后形成帶 loop 環(huán)的雙鏈 miRNA 進入細胞質(zhì)。

• 經(jīng)過 Dicer酶（一種具有 RNAaseⅢ 活性的核酸酶）的加工，細胞中較長的雙鏈 RNA (30 個核苷酸以上）首先被降解（切掉 loop 環(huán)）形成 21～25 個核苷酸的小分子干擾核糖核酸 (siRNA，short interfering RNA），并有效地定位目標 mRNA。siRNA 是導致基因沉默和序列特異性 RNA 降解的重要中間媒介。

• 較短的雙鏈 RNA 不能被有效地加工為 siRNA, 因而不能介導 RNAi。

• siRNA 具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即 5’-Pi 和 3’-OH，其兩條鏈的 3’端各有兩個堿基突出于末端。由 siRNA 中的反義鏈指導合成一種被稱為 RNA 誘導的沉默復合體 (RISC) 的核蛋白體，再由 RISC 介導切割目的 mRNA 分子中與 siRNA 反義鏈互補的區(qū)域，從而實現(xiàn)干擾靶基因表達的功能。

• siRNA 還可作為特殊引物，在依賴于 RNA 的 RNA 聚合酶的作用下，以目的 mRNA 為模板合成 dsRNA, 后者又可被降解為新的 siRNA, 重新進人上述循環(huán)。因此，即使外源 siRNA 的注入量較低，該信號也可能迅速被放大，導致全面的基因沉默。

• 在哺乳動物細胞內(nèi)，較長的 dsRNA 會導致非特異性基因沉默，只有 21~25 個核苷酸的 siRNA 才能有效地引發(fā)特異性基因沉默 。

• 非哺乳動物細胞可以利用較長的雙鏈 RNA 直接誘導產(chǎn)生 RNAi 而無須合成 siRNA, 因此，設計非哺乳動物細胞 RNAi 實驗的步驟比較簡便，只要通過目的基因體外轉(zhuǎn)錄得到所需要的 dsRNA, 再通過浸泡，注射或轉(zhuǎn)染靶細胞即可實現(xiàn) RNAi。

8.1.4 基因敲除 (gene knock-out) 技術(shù)

• 經(jīng)典遺傳學 (Forward genetics）是從一個突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進而找出該基因的編碼序列。
• 現(xiàn)代遺傳學 (Reverse genetics，反向遺傳學）首先從基因序列出發(fā)，推測或者觀察表現(xiàn)型，進而推導出該基因的功能。
• 基因敲除 (gene knock-out) 又稱基因打靶，通過外源 DNA 與染色體 DNA 之間的同源重組，進行精確的定點修飾和基因改造，具有專一性強、染色體 DNA 可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點。

基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）兩種。
完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動植物個體中的靶基因活性。
條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除。

(1) 完全基因敲除實驗

完全基因敲除實驗中一般采用取代型 (a) 或插入型 (b) 載體在 ES 細胞（胚胎干細胞 embryonic stem cell）中根據(jù)正-負篩選 ( positive-negative selection, PNS) 原理進行完全基因敲除實驗。

• 正向選擇基因 neo 通常被插入載體靶 DNA 功能最關鍵的外顯子中，或通過同源重組法置換靶基因的功能區(qū)。neo 基因有雙重作用，一方面形成靶位點的插入突變，同時可作為正向篩選標記。
• 負向選擇基因 HSV-tk (human semian virus-thymidine kinase，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因） 則被置于目的片段外側(cè)，含有該基因的重組細胞不能在選擇培養(yǎng)基上生長。如果細胞中發(fā)生了隨機重組，負向選擇基因就可能被整合到基因組中，導致細胞死亡。
• 正-負篩選法 (PNS 法） 篩選已發(fā)生同源重組的細胞（此方法效率低，現(xiàn)已不用于做基因敲除，用 CRISPR 方法）
  
  ◆ 目標序列的關鍵外顯子中插入 neo^r 基因，兩側(cè)為 HSV-tk；
  ◆ 在 ES 細胞中發(fā)生同源重組后，neo^r 基因插入基因組中，而 HSV-tk 基因被剪切掉；
  ◆ 發(fā)生重組的 ES 細胞由于有 neo^r 基因而獲得對新霉素 G148 抗性。因為缺失了 HSV-tk 基因，轉(zhuǎn)化細胞同時具有嘌呤類似物丙氧鳥苷抗性。

高等動物基因敲除技術(shù)

• 真核生物基因敲除的技術(shù)路線：構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組 DNA 導入胚胎干細胞純系中，使外源 DNA 與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的 DNA 序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達。
• 顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對大些。
• 電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。
• 胚胎干細胞（ES 細胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術(shù)基礎。

模式動物小鼠中完全基因敲除的主要技術(shù)策略與應用

• 腸堿性磷酸酶（Intestinal Alkaline Phosphatase，IAP）基因敲除加速小鼠肥胖
  
• (a) 利用 neo 基因替換目的基因外顯子Ⅳ至外顯子Ⅵ區(qū)段，得到 IAP 基因敲除的 ES 細胞。P. 內(nèi)源 Southern 印跡探針。
• (b) Southerm 印跡實驗 （DNA 水平），AP 基因已從基因組中敲除。
  ◆ D3, 來自于親本 ES 細胞的 DNA;
  ◆ # 48, IAP 基因敲除的 ES 細胞 DNA;
  ◆ +/+、+/-和-/-分別代表野生型、雜合體和純合體。
• (c ) Northem 印跡實驗 （RNA 水平），純合小鼠體內(nèi) IAP 基因不表達。
• (d) Western 印跡實驗 （蛋白質(zhì)水平）。純合小鼠體內(nèi)檢測不到 IAP 蛋白。TNAP, 非組織特異性堿性磷酸酶。
• (e) 在高脂飼養(yǎng)條件下，IAP 基因敲除的小鼠 ( ko) 較野生型小鼠 ( wr) 更易發(fā)胖。

(2) 條件型基因敲除

• 噬菌體的 Cre/LoxP 系統(tǒng)、Gin/Gix 系統(tǒng)、酵母細胞的 FLP/FRT 系統(tǒng)和 R/RS 系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種條件型定位重組系統(tǒng)，尤以 Cre/LoxP 系統(tǒng)應用最為廣泛。

Cre/LoxP 系統(tǒng)

• Cre 是來自大腸桿菌噬菌體 P1 中的一種特異重組酶，能識別 34bp 的 loxP 序列（序列短，容易插入基因組），并介導兩個 loxP 位點之間的基因序列被刪除或重組。

• loxP 序列：來源于 P1 噬菌體，是由兩個 13bp 反向重復序列和中間間隔的 8bp 序列共同組成，8bp 核心序列同時也確定 LoxP 的方向。Cre 在催化 DNA 鏈交換過程中與 DNA 共價結(jié)合，13bp 的反向重復序列是 Cre 酶的結(jié)合域。其序列如下：
  5’ - ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT - 3’
  3’ - TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATA - 5’

• Cre 重組酶介導兩個 LoxP 位點間的重組是一個動態(tài)、可逆的過程，可以分成三種情況：
  
  ◆ Cre-lox 重組的結(jié)果取決于側(cè)翼 loxP 位點的方向和位置：
  ① 如果兩個 LoxP 位點位于一條 DNA 鏈上，但方向相反，Cre 重組酶能導致兩個 LoxP 位點間的序列 倒位；
  ② 如果兩個 LoxP 位點分別位于兩條不同的 DNA 鏈或染色體上（反式排列），Cre 酶能介導兩條 DNA 鏈的交換或染色體易位。
  ③ 如果兩個 LoxP 位點位于一條 DNA 鏈上，且方向相同（順式排列），Cre 重組酶能有效切除兩個 LoxP 位點間的序列。

條件型基因敲除策略

• 條件型基因敲除打靶載體時，常將正向選擇標記 neo^r 置于靶基因的內(nèi)含子中，并在靶基因重要功能域（如圖中 Exon 2）兩側(cè)內(nèi)含子中插入方向相同的 LoxP 位點。
• 當實驗中需要消除靶基因活性時，與帶有 Cre 重組酶基因的 ES 細胞雜交，Cre 重組酶就能把兩個 LoxP 位點中間的 DNA 片段切除，導致靶基因失活。
• 標記基因 neo^r 兩側(cè)也常常帶有 LoxP 序列，因為許多時候即使標記基因位于內(nèi)含子中也會阻斷靶基因的轉(zhuǎn)錄。一旦出現(xiàn)這種情況，可以用 Cre 重組酶表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶 ES 細胞，通過 LoxP 位點重組將 neo 抗性基因刪除。

肝組織特異性表達 Cre-Lox 系統(tǒng)條件型敲除小鼠 40S 核糖體蛋白 S6 基因導致肝細胞分裂增殖受阻

● Conditional KO mice: inducible cre-lox recombination
Cre 重組酶融合至突變體雌激素配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其需要存在雌激素拮抗劑他莫昔芬用于激活重組酶 (CreERT2）。

● 細胞特異性 Tet-ON （四環(huán)素誘導的表達系統(tǒng)）
TetO（四環(huán)素響應啟動子/操縱子）在用四環(huán)素類似物強力霉素（DOX）激活反向四環(huán)素反式激活因子 (rtTA）后驅(qū)動 cre 重組酶的表達。

基因捕獲法原理

• 除了基因敲除法，還有人用基因捕獲的方法通過隨機插入突變破壞靶基因表達。
• 基因捕獲載體包括一個無啟動子的報告基因（通常為 neo^r 基因）, 當該基因插入到 ES 細胞染色體某個部位，利用所在位點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件得到表達時，該 ES 細胞就獲得在含 G418 的選擇性培養(yǎng)基上生長的能力。可通過分析標記基因側(cè)翼 cDNA 或染色體 DNA 序列來獲得靶基因的相關信息。

• A、未插入基因捕獲載體前，需要被敲除的靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯出活性蛋白質(zhì)，未知；
• B、插入基因捕獲載體后，靶位點基因轉(zhuǎn)錄翻譯出帶有 GUS 蛋白區(qū)段的融合蛋白，可用組化方法檢測。
• Gus 基因來自于大腸桿菌，編碼 β-葡聚糖苷酶 (β-glucuronidase，一種水解酶），可催化底物 5-溴-4-氯-3-吲哚葡聚糖醛酸苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide, 縮寫為 x-Gluc）分解，產(chǎn)生肉眼可見的深蘭色化合物，借此用來觀察轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的表達情況，鑒定轉(zhuǎn)基因植株。

植物基因敲除技術(shù)

• T-DNA 插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。
• 利用根癌農(nóng)桿菌 T-DNA 介導轉(zhuǎn)化，將帶有報告基因的 DNA 序列整合到基因組 DNA 上，如果這段 DNA 插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會影響該基因的表達，從而使該基因“失活”。
• 由于該基因內(nèi)部或附近插入了一段已知序列的 DNA, 可據(jù)此設計引物，用 PCR 方法將被破壞的靶基因序列分離出來。
• 植物基因敲除及突變體篩選
  
  若將靶基因（假定編碼區(qū)為 900 bp) 兩端的引物 LP、RP 及插入載體上的引物 LB 加入同一反應體系中進行 PCR, 理論上能得到三種類型的條帶：
  ◆ 野生型植株中，只有 LP 和 RP 引物配對擴增出來的靶基因條帶；
  ◆ 純合型基因敲除植株，只有靶基因一端的引物可以與 LB 引物配對完成 PCR 擴增；
  ◆ 雜合型基因敲除植株，PCR 擴增后會同時出現(xiàn)兩種條帶。

基因的定點整合技術(shù)

（一） TALEN 介導的基因組定點修飾技術(shù)

• TALEN: transcription activator-like effector nucleases 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶，是一類人工核酸內(nèi)切酶。由特異性的TALE DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性FokⅠ核酸內(nèi)切酶切割結(jié)構(gòu)域組成。
• 人工構(gòu)建的序列特異性核酸內(nèi)切酶能識別并切割特定的 DNA 靶序列，造成雙鏈斷裂，從而引起基因組結(jié)構(gòu)的定點改變。
• 參考資料★★★：TALEN 介導的基因組定點修飾技術(shù) .ppt

● TALE 識別模塊

• RVD: Repeat variable di-residue 重復可變雙殘基
  NLS: Nuclear localization signal 核定位信號
  AD: Activation domain 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域
• TALE 蛋白 N 端一般有轉(zhuǎn)運信號；C 端有核定位信號和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域；中部 則是介導其與 DNA 特異識別與結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，包含一段 12 個或以上的長串聯(lián)重復序列。
• 在每個重復單位中，包含 34 個氨基酸，第 +12 和+13 位氨基酸殘基是靶向識別堿基的關鍵位點，隨靶點核苷酸序列的不同而異，被稱作重復可變雙殘基 (Repeat variable di-residue, RVD)；其他位置的氨基酸殘基則相對固定。
• 每個 RVD 只能識別一個堿基。最常見的 4 種 RVD 分別是 NI(Asn Ile) 識別 A、NG(Asn Gly) 識別 T、HD(His Asp) 識別 C、 NN(Asn Asn) 識別 G/A。TALE 的重復單元與靶序列一一對應。

● TALEN 介導的基因組定點修飾流程

• 在實際操作中，需在目標基因的編碼區(qū)或外顯子和內(nèi)顯子的交界處選擇兩處相鄰（間隔 13-22 堿基）的靶序列（一般 16-20 個堿基）分別進行 TALE 識別模塊構(gòu)建。將這兩個相鄰靶點識別模塊（分別）融合克隆到 FokⅠ 的 N-末端，形成真核表達載體，得到 TALEN 質(zhì)粒對。將 TALEN 質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞中可實現(xiàn)靶基因敲除。
• TALEN 質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞后，表達的融合蛋白，分別與靶位點特異結(jié)合，由于兩個 TALEN 融合蛋白中的 FokⅠ 臨近，形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性（FokⅠ只有形成二聚體才切），在兩個靶位點之間剪切 DNA，造成 DNA 雙鏈斷裂 DSB (Double-Strand Breaks，DSB)，誘發(fā) DNA 損傷修復機制。
• 切割后（細胞 DNA 損傷后）會啟動兩種修復機制：
  ① 非同源末端連接 NHEJ（Non-homologous End Joining）修復：簡單高效，錯誤率高，>70% 產(chǎn)生基因突變，造成移碼，形成目標基因敲除突變體。
  ② 同源重組 HR 修復：有模板存在時發(fā)生同源重組，造成基因敲入和修改，效率低，保真度高。

● TALEN 靶位點的挑選原則：

• TALEN 靶位點 5 端的前一位（第 0 位）堿基應為胸腺喀啶 (T)
• 設計 TALEN 靶點網(wǎng)站：TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0

（二） CRISPR/Cas 系統(tǒng)

• 在原核生物中，聚集的規(guī)則間隔短回文重復序列 (CRISPR）和 CRISPR 相關 (Cas) 系統(tǒng) (clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated proteins system) 是針對病毒和質(zhì)粒的適應性免疫應答細胞，使用引導 RNA 來切割外源 DNA 序列。
• Ⅱ型 CRISPR 系統(tǒng) 體外切割所需的最小組分是來自化膿鏈球菌 (Streptococcus pyogenes）的 Cas9 核酸酶和合成的指導 RNA (sgRNA)。sgRNA 由短 CRISPR RNA(crRNA）和反式激活 CRISPR RNA ( tracrRNA）組成。
• 原理與 TALEN 類似，不同的是，CRISPR/Cas 是通過 sgRNA 來識別靶 DNA 序列。

CRISPR/Cas9 介導的基因組編輯

• CRISPR 系統(tǒng)使用單個指導 RNA（紅色）靶向感興趣的 DNA。
• Cas9 核酸酶（綠色）識別 sgRNA 和 RNA:DNA 雜交體的二級結(jié)構(gòu)。通過 crRNA 內(nèi)的 20bp 序列提供基因組特異性。
• Cas9 還需要原型間隔區(qū)基序 5’-NGG-3’ (Protospacer-Adjacent Motif, PAM）來切割 DNA。

• CRISPR/Cas9 切割后修復：
  1）基因敲除：在基因上產(chǎn)生 DSB ( 3bp upstream of the PAM site )，NHEJ 修復的過程中往往會產(chǎn)生 DNA 的插入或刪除（indel)，造成移碼突變，從而實現(xiàn)基因敲除。
  2）特異突變引入：通過含有特異突變同源模板的同源重組 (homology directed repair，HDR) 來實現(xiàn)。DSB 會極大的提高重組效率，從而實現(xiàn)特異突變的引入。
  3）定點轉(zhuǎn)基因：通過含有轉(zhuǎn)基因的同源模板的同源重組來實現(xiàn)。通過定點轉(zhuǎn)基因的方法可以把基因插入到人的基因組 AAVS1 位點，這個位點是一個開放位點，支持轉(zhuǎn)基因長期穩(wěn)定的表達，破壞這個位點對細胞沒有不良影響。

• CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已不僅僅是一種革命性的基因編輯工具，還能在各種原核和真核生物中調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。Cas9 的核酸酶發(fā)生雙突變產(chǎn)生失活的 dCas9，即“dead Cas9"”，這種核酸酶失去切割 DNA 的功能，但在 gRNA 的指導下仍能以相同的精確度靶向和結(jié)合 DNA。

• 參考文獻： Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells
  有別于絕大多數(shù)體細胞基因組，適應性免疫系統(tǒng)在淋巴細胞發(fā)育過程中可以進行高效編輯，對抗原受體進行高效突變，產(chǎn)生近乎無限的抗原受體庫，用以抵御可能的病原體入侵。受這一機制的啟發(fā)，研究小組發(fā)現(xiàn)誘導抗體高頻突變的胞喀啶核苷脫氨酶（ activation-induced cytidine deaminase，AID）與失活的 dCas9 融合后，實現(xiàn)了功能變異的高通量篩選。在 sgRNAs 的引導下，dCas9-AID-P182X(AIDx) 可直接將胞密啶 C 或鳥嘌呤 G 轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌N堿基，在預期位點產(chǎn)生一系列的變異。

• 參考資料：
  CRISPR/Cas 技術(shù)及其作用機制
  CRISPR-dCas9 轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)簡介

單堿基編輯 Single base editing

• 參考文獻： Programmable base editing of AT to G·in genomic DNA without DNA cleavage
  
• 不同于 CRISPR，堿基編輯不會切割雙螺旋，而是使用酶將堿基轉(zhuǎn)換為堿基而不改變其周圍的堿基。
• 利用 CRISPR-dCas9 定位到目標堿基處，dCas9 融合了一種特殊的酶（能對堿基發(fā)生修飾）

載體構(gòu)建實例解析
詳見：載體構(gòu)建實例解析——構(gòu)建 SETD3-pEGFP-N1

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8.2 基因表達檢測技術(shù)

為研究單個或多個基因在生物體某些特定發(fā)育階段或在不同環(huán)境條件下的表達模式提供了強有力的手段。

基因組序列的測定

基因組（genome）是生物體內(nèi)遺傳信息的集合，是某個特定物種細胞內(nèi)全部 DNA 分子的總和。
基因組學（genomics）是指研究并解析生物體整個基因組的所有遺傳信息的學科。

● 不同模式生物基因組的比較

鳥槍法序列測定技術(shù)

• 全基因組鳥槍法測序 (shotgun sequencing) 技術(shù)：隨機挑選帶有基因組 DNA 的質(zhì)粒進行末端序列測定，然后用計算機程序進行序列拼接。
• 鳥槍法測序的主要缺點：
  1）隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量增加；
  2）高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復序列，無法知道拷貝數(shù)，導致判斷失誤。

組裝單個序列

1）將各個測序讀數(shù)相互比較，并將它們重疊的位置組合以產(chǎn)生重疊群；
2）繼續(xù)添加單個測序讀數(shù)以構(gòu)建更大和更少的重疊群；
3）最終，所有測序讀數(shù)合并為每個染色體的單個共有序列 (大重疊群）。

基因表達通量檢測技術(shù)轉(zhuǎn)錄組學研究

• 轉(zhuǎn)錄組 (transcriptome)，廣義上指在某一特定生理條件或環(huán)境下，一個細胞、組織或者生物體中所有 RNA 的總和，包括信使 RNA (mRNA)、核糖體 RNA (rRNA)、轉(zhuǎn)運 RNA ( tRNA) 及非編碼 RNA (non-coding RNA 或 siRNA)。現(xiàn)常指細胞中轉(zhuǎn)錄出來的所有 mRNA 的總和。
• 基因組-轉(zhuǎn)錄組-蛋白質(zhì)組（genome-transcriptome-proteome) 是中心法則在組學框架下的主要表現(xiàn)形式。
• 通過特定生理條件下細胞內(nèi)的 mRNA 豐度來描述基因表達水平并外推到最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物的豐度是目前基因表達研究的基本思路。

● 基于傳統(tǒng)的 Sanger 測序法對轉(zhuǎn)錄組進行研究的方法主要包括：
① 表達序列標簽 (expressed sequence tag, EST) 測序技術(shù)：

• 在遺傳學中，表達序列標簽或 EST 是 cDNA 序列的短子序列。用于 EST 產(chǎn)生的 cDNA 通常是來自 cDNA 文庫的單個克隆。
• EST 測序數(shù)據(jù)是目前數(shù)量最多、涉及物種最廣的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，但測序讀長較短（每個轉(zhuǎn)錄物測定 400 ~ 500 bp)，測序通量小，測序成本較高，而且無法通過測序同時得到基因表達豐度的信息。
• ESTs 可用于鑒定基因轉(zhuǎn)錄物，并有助于基因發(fā)現(xiàn)和基因序列測定。
• EST 代表表達基因的部分序列。它們在數(shù)據(jù)庫中可以表示為 cDNA /mRNA 序列或作為 mRNA 的反向互補物，即模板鏈。
• EST 包含足夠的信息以允許設計用于 DNA 微陣列的精確探針，然后可用于確定基因表達。

② 基因表達系列分析 (serial analysis of expression, SAGE) 技術(shù)。有人使用 SAGE 測序法，用不同轉(zhuǎn)錄物 3’端第一個 CATG 位點下游 14 bp 長的短標簽序列來標識相應的轉(zhuǎn)錄物。由于標簽序列較短，可以將多個標簽串聯(lián)測序，使 SAGE 法相對于 EST 測序在通量上大大提高。但過短的序列標簽降低了序列的唯一性，即使用改進過的 LongSAGE(21 bp) 標簽測序，仍然有一半的標簽無法被準確注釋到基因組上。

高通量測序技術(shù) (high-throughput sexquencing) ，又名二代測序 (second-generation sequencing) 或深度測序 (deep sequencing), 可以一次性測定幾十萬甚至幾百萬條序列，是傳統(tǒng)測序技術(shù)的一次革命，主要有 454 測序平臺和 Solexa 測序平臺。

基因表達水平檢測

• Northern 雜交：檢測 RNA 表達水平
• 表達序列標簽（expressed sequence tag，EST）測序技術(shù)
• 基因芯片技術(shù) (DNA/RNA chip)
• 數(shù)字表達譜 DGE (Digital Gene Expression)

原位雜交技術(shù)

• 原位雜交 (In Situ Hybridization，ISH) 是用標記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段，分為 RNA 和染色體原位雜交兩大類。
• RNA 原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標記的特異性探針與被固定的組織切片反應，若細胞中存在與探針互補的 mRNA 分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈 RNA，可通過放射性標記或經(jīng)殉促免疫顯色，對該基因的表達產(chǎn)物做出定性定量分析。
• 用 mRNA 的互補鏈為探針進行雜交。負對照，mRNA 的同義鏈，無雜交信號。
• 熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 技術(shù)首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標記，然后用原位雜交法與靶染色體或 DNA 上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該 DNA 序列在染色體上的位置。
• FISH 技術(shù)不需要放射性同位素，實驗周期短，檢測靈敏度高，若用經(jīng)過不同修飾的核苷酸分子標記不同的 DNA 探針，還可能在同一張切片上觀察幾種 DNA 探針的定位，得到相應位置和排列順序的綜合信息。

表達芯片/基因芯片

• 基因芯片（DNA chip），又稱 DNA 微陣列 (DNA microarray）技術(shù)是能同時監(jiān)測大量靶基因表達的實驗手段，從而迅速準確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律。
• 基因芯片可用于進行基因診斷。先建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標準雜交信號圖，用可疑病人的 cDNA 做探針與之雜交，確定哪些基因的表達受抑制或激活。

數(shù)字表達譜 (Digital Gene Expression)

• 數(shù)字基因表達譜（Digital Gene Expression Profiling, DGE）利用新一代高通量測序技術(shù)和高性能計算分析技術(shù)，能夠全面、經(jīng)濟、快速地檢測某一物種特定組織在特定狀態(tài)下的基因表達情況。
  

DNA 測序技術(shù)

● 第一代測序技術(shù) Sanger dideoxy sequencing

● 第二代測序技術(shù)

• Roche 454 Pyrosequencing
• lllumina Solexa cyclical base addition
• ABI SOLiD sequencing by ligation

● 第三代測序技術(shù)

• Single molecule sequencing
• Heliscope (cyclical base addition)
• Pacific Biosciences

8.2.1 第一代測序技術(shù) Sanger dideoxy sequencing

● 第一代測序技術(shù)的特點

DNA 片斷化

克隆到質(zhì)粒載體上

循環(huán)測序反應

通過電泳分離

帶熒光標簽的讀數(shù)

<1000bp/read, 96 lanes

● 原理：sanger 法測序 及 雙脫氧鏈終止法，它采取 DNA 復制原理，通過在 DNA 復制過程中添加雙脫氧三磷酸核苷酸（ddNTP），由于它沒有 3’-OH，故不與下一個 dNTP 結(jié)合，從而使鏈延伸終止。ddNTP 在不同位置摻入，因而在 DNA 鏈不同位置發(fā)生延伸終止，產(chǎn)生一系列不同長度的新的 DNA 鏈，判斷該位置的堿基類型。但是凝膠電泳的時間較長，導致 sanger 法測序通量低。

● 核糖核苷三磷酸 (NTP)、脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTP) 和雙脫氧核糖核三磷酸 (ddNTP) 的結(jié)構(gòu)

● DNA 合成是生成磷酸糖苷鍵的過程：單核苷酸 5’-磷酸基團向核酸鏈的 3’-OH 發(fā)起進攻。

● 目前所有測序都是以單鏈 DNA 為模板，在引物存在的情況下，讀加上去的堿基，測序?qū)嶋H上是 DNA 邊合成邊檢測的過程。

Sanger-Coulson 測序（使用單鏈 DNA 的鏈終止方法）

將待測序的樣品 DNA 克隆到 M13 載體 DNA 中以產(chǎn)生單鏈 DNA (ssDNA)。

將短寡核苷酸引物（化學合成并有時標記）加入單鏈重組 DNA 中。

然后將 DNA 聚合酶（Klenow 大片段，無 5’-3’ 外切酶活性）加入 ³²P 標記的 dNTP 混合物分別加入四種低濃度的 ddNTP（極少量，所以會隨機發(fā)生 DNA 合成終止，得到很多提前終止的產(chǎn)物）。注意：這里是標記 dNTP，不標記 ddNTP。

發(fā)生互補鏈合成。

4 種混合物電泳，測序凝膠根據(jù)其大小通過電泳分離片段。通過放射自顯影觀察凝膠中的 DNA 條帶。

直接從凝膠中讀取 DNA 序列。

Sanger 測序法的改進 (ABI 3730)

• 熒光標簽代替放射性同位素：4 種不同的雙脫氧核苷酸 (ddA，ddC，ddG 和 ddT) 被熒光標記。使用 4 種不同的熒光團，所有 4 種反應均可在同一管中進行。注意：這里是標記 ddNTP，不標記 dNTP。
• 毛細管電泳代替普通的平板電泳。
• 自動化操作。
  

8.2.2 第二代測序技術(shù)

• 原理：加堿基-讀-洗 循環(huán)。先擴增，得到大量模板，然后一個個加堿基，加一個堿基就停止反應，洗掉，再換另一個堿基，再停止反應洗掉，以此循環(huán)。例如先加 A，所有能結(jié)合的就發(fā)光，洗掉保護基團，再換 T，再換 C、G…

• 核心技術(shù)：
  ① 橋式 PCR，主要用于擴大信號；
  ② 4 色熒光可逆終止反應，使 illumina 測序可以實現(xiàn)邊合成邊測序的技術(shù)。

8.2.2.1 Roche / 454 : Genome Sequencer FLX

● Roche / 454 的特點

• 實時合成測序：454 焦磷酸測序直接檢測核苷酸合成時相應產(chǎn)物誘發(fā)的光信號，是基于合成的實時測序。
• 皮升滴定板中的化學發(fā)光檢測
• 擴增：乳膠 PCR (Emulsion PCR)。
• 焦磷酸測序
• up to 1,000,000 reads / run
• on average 700 bases / read
• up to 700 Mb / run

● 原理：將隨機片段化后的基因組 DNA 變性成單鏈并稀釋，讓每個磁珠通過表面引物“捕獲”至多一個 DNA 分子。然后每個磁珠在封閉的 乳膠小泡中 PCR 擴增至數(shù)千拷貝（模板），再次變性去除游離的 DNA 分子。富集磁珠并置于光纖載片的小槽內(nèi)，以 4 種天然核苷酸為底物合成互補鏈。當某個新添加的核苷酸被整合到延伸的 DNA 鏈中，它 釋放的焦磷酸被硫酸化酶轉(zhuǎn)化成 ATP，熒光素酶利用這個 ATP 催化熒光素釋放光信號，被光纖束連接的 CCD 檢測到。

● 將一種比 PTP 板 (Pico TiterPlate) 上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動測序反應。測序反應以磁珠上大量擴增出的單鏈 DNA 為模板，每次反應加入一種 dNTP 進行合成反應。

● 優(yōu)點：相對其它二代測序技術(shù)，主要優(yōu)點是測序讀長較長（平均讀長 400bp，因為沒有對 dNTP 做修飾，反應可以不斷進行），應用于從頭拼裝測序等。

● 缺點：由于沒有對底物核苷酸進行任何末端終止的修飾，無法準確測量同聚物（重復序列）的長度，如當序列中存在類似于 PolyA 的情況時，測序反應會一次加入多個 T，而所加入的 T 的個數(shù)只能通過熒光強度推測獲得（隨著反應的進行，熒光強度會逐漸衰減，所測的熒光強度不能準確反應堿基數(shù)量），這就有可能導致結(jié)果不準確。

● 堿基插入和缺失 是該方法的主要測序錯誤。

焦磷酸測序技術(shù) ★★★

• 焦磷酸測序技術(shù)是由 4 種酶催化的同一反應體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應。
• 焦磷酸測序技術(shù)的原理是：引物與模板 DNA 退火后，在 DNA 聚合酶 (DNA polymerase)、ATP 硫酸化酶 (ATP sulfurytase)、熒光素酶 (luciferase) 和三磷酸腺苷雙磷酸酶 (Apyrase) 4 種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個 dNTP 的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定 DNA 序列的目的。
• 焦磷酸測序技術(shù)的反應體系：反應底物、待測單鏈、測序引物和 4 種酶構(gòu)成。
• 反應底物： 5’-磷酰硫酸 (adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、熒光素 (luciferin)。
• 反應過程：在 每一輪測序反應中，反應體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸 (dNTP)。如果它剛好能和 DNA 模板的下一個堿基配對，則會在 DNA 聚合酶的作用下，添加到測序引物的 3’末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸 (PPi)。在 ATP 硫酸化酶的作用下，生成的 PPi 可以和 APS 結(jié)合形成 ATP, 在熒光素酶的催化下，生成的 ATP 又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光。通過微弱光檢測裝置及處理軟件可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。如果加入的 dNTP 不能和 DNA 模板的下一個堿基配對，則上述反應不會發(fā)生，也就沒有檢測峰。反應體系中剩余的 dNTP 和殘留的少量 ATP 在 Apyrase 的作用下發(fā)生降解。待上一輪反應完成后，加入另一種 dNTP，使上述反應重復進行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準確的 DNA 序列信息。
• 焦磷酸測序技術(shù)的應用：研究單核苷酸多態(tài)性 (single ucleotidepolymor—phism，SNP)，遺傳多態(tài)性，植物多態(tài)性分析，分子診斷細菌與病毒分型、甲基化分析、法醫(yī)鑒定及藥物基因組學等方面都有廣泛的應用。
• 該技術(shù)不需要凝膠電泳，也不需要對 DNA 樣品進行任何特殊形式的標記和染色，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點。

8.2.2.2 lllumina Solexa cyclical base addition

● lllumina 二代測序流程

制備單鏈模板

成簇 cluster：擴增模板，放大信號

測序

數(shù)據(jù)分析：讀數(shù) counts

lllumina / Solexa: 遺傳分析儀的特點

• 實時合成測序
• 克隆單分子陣列
• 擴增：橋接 PCR
• 3 billions reads / run
• 100-250 bases / read
• 600 Gb / run
• 8 channels（一次可測 8 個樣品）, ~400 mill reads / channel
• 熒光標簽：加入的每個堿基都有熒光標記
• 可逆 3’-OH 阻斷
• 11 days for 2x100bp

基于可逆終止子的測序 (Solexa)

• 反應過程：先隨機片段化基因組 DNA，然后將各個單鏈模板與固相基底上的正、反向 PCR 引物 隨即雜交引起互補鏈合成，隨后經(jīng)過 DNA 變性引起 鄰近引物橋式擴增。不同模板生成的擴增子集群散布在基底的不同位置，形成陣列。測序過程中，測序引物與模板末端的共同接頭序列雜交，在 DNA 聚合酶催化下以 4 種 3’-OH 位置加了一個可切除修飾基團的核苷酸為底物合成互補鏈。每一輪鏈延伸只有一個堿基整合，因為修飾基團會阻止下一個核苷酸整合。每個核苷酸還帶有一個可切除的熒光標記基團。也就是說，每一輪鏈延伸，都檢測一遍熒光圖像信號，檢測完后切除修飾基團和熒光基團，進入下一輪合成。
• 調(diào)用原始數(shù)據(jù)，從連續(xù)圖像中依次讀出每一個熒光簇的不同顏色信號：每一種顏色代表一種堿基。

lllumina 測序的基本化學原理：Sanger Sequencing 雙脫氧鏈終止法

• 詳見：illumina 二代測序原理及過程 ★★★
• 單鏈模板制備：加 1% NaOH。
• 可逆 3’-OH 阻斷：阻斷 3’-OH 可終止延伸，實現(xiàn)加一個堿基就停止反應；這個阻斷過程是可逆的，能繼續(xù)加下一個堿基。
• 對堿基修飾：帶有可切除的熒光基團和修飾基團的堿基。ATCG 帶不同顏色的熒光基團；可切除的修飾基團實現(xiàn)可逆的 3’-OH 阻斷。
• 讀取堿基的原理：模板在板上固定位置形成簇，每個簇的位置是固定的（即模板是固定的，同一個位置測的是同一條鏈），因此，根據(jù)每一次反應后板上的熒光變化，即可分辨加上的堿基。
• Solexa 系統(tǒng)主要的錯誤出在 堿基替換。
• 讀長受限的原因 （為什么不能像一代測序一樣測 500bp 以上？)
  ① 修飾基團去除不完全，導致恢復 3’-OH 的反應后會產(chǎn)生“小尾巴”，而不是完全復原成原來的堿基，隨著鏈的延伸，積累的“小尾巴”導致與模板結(jié)合不穩(wěn)，延伸反應無法進行；
  ② 熒光基團去除不完全：加了一個堿基后，要加下一個堿基，需要先把前面加的堿基上的熒光基團去掉，否則影響下個堿基的讀取，但往往熒光基團去除不完全，會產(chǎn)生背景，并隨著反應進行逐漸積累加深，影響熒光信號讀取的準確性。
  ③ 測序時經(jīng)過長時間的 PCR，會有不同步的情況。比如一開始 1 個 cluster 中是 100 個完全一樣的 DNA 鏈，但是經(jīng)過 1 輪增加堿基，其中 99 個都加入了 1 個堿基，顯示了紅色，另外 1 個沒有加入堿基，不顯示顏色。這時候整體為紅色，我們可以順利得到結(jié)果。隨后，在第 2 輪再加入堿基進行合成的時候，之前沒有加入的加入了 1 個堿基顯示紅色，剩下的 99 個顯示綠色，這個時候就會出現(xiàn)雜信號 。當測序長度不斷延長，這個雜信號會越來越多，最后很有可能出現(xiàn) 50 個紅，50 個綠色，這時信號不足以判斷堿基類型；
  ④ 就是測序過程中 合成酶的活性 越來越不穩(wěn)定，后面堿基添加出現(xiàn)問題。

● Deep Sequencing Technologies

TechnologiesPurposes

RNA-seq (3’ end)	Gene expression profiling
ChlP-seq	DNA-protein interactions
GRO-seq	Nascent RNA production 新生 RNA
CLIP-seq	RNA-protein interactions
RASL-seq (small scale)	Splicing profiling
RASL-seq (large scale)	Large-scale target gene expression
sRNA-seq	microRNA profiling

● RNA-seq for 3’ end (MAPS)

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8.2.2.3 ABI SOLiD sequencing by ligation （用得不多）

● ABI SOLiD - Sequence by Oligonucleotide Ligation with Dual-base Encoding

• 基板附著雙堿基探針
• 通過剪切和適配器連接制作測序文庫
• 將 DNA 片段連接到珠子上并乳膠 PCR 擴增
• 將 DNA 附著到玻片上
  
  三個 N 核苷酸是簡并堿基，可以是 A，C，T 或 G 中的任何一個。最后三個 Z 核苷酸是可以與四個核苷酸堿基中的任何一個配對的通用堿基。

● SOLiD: Sequencing ligation cycles 測序連接循環(huán)過程

● SOLiD 系統(tǒng)采用雙堿基編碼探針，片段化基因組 DNA 后用乳膠 PCR 進行擴增，這些步驟和 Roche 454 系統(tǒng)類似。測序引物與模板 DNA 雜交后，啟動八核苷酸探針與模板的雜交。從第 n 位堿基開始，用 DNA 連接酶催化連接、采集熒光信號、切除探針后三位核苷酸及所標記的熒光標簽三步循環(huán)。簡并八核苷酸探針的第一位和第二位堿基決定探針的熒光標記顏色。10 次循環(huán)，產(chǎn)生 10 個熒光信號，對應 DNA 序列上每 5 個堿基中的前兩個堿基序列。10 次循環(huán)后，變性恢復單鏈模板，選用不同引物，從 n-1 位堿基重新開始 10 個循環(huán)，以此類推。
● SOLiD 系統(tǒng)的主要錯誤在于堿基替換，測序通量最大，讀長較短。

● SOLiD 解碼序列

• 每種顏色表示兩個堿基。
• 由于每種顏色代表兩個核苷酸，其中每個二核苷酸單元的第二個堿基構(gòu)成下個二核苷酸的第一個堿基，因此只要知道序列中的一個堿基將導致我們解釋整個序列。

● ABI SOLiD/Life Technology

• 通過連接實時測序
• 珠子和乳液 PCR 在載玻片上進行
• 2.5 billion reads / run
• 35-75 bases / read
• 100 Gb / run
• 雙熒光標簽
• 8 individual channels / flowcell
• 2 flowcells / run
• 14 days for 2x50bp

3 種二代測序技術(shù)的共同特征：循環(huán)陣列方法

• DNA 片斷化
• 測序接頭連接到 DNA 片段上
• 幾種可能的方案產(chǎn)生 PCR 克隆陣列——擴增
• 具有熒光標記的核苷酸的酶促延伸
• 通過對陣列成像進行循環(huán)讀出

二代測序平臺的弱點

● 群體效應所導致的誤差，因而讀序短

• 化學反應效率不完全：聚合反應、鏈終止解封反應。
• 光信號檢測誤差：失去族群同步性、族群光信號失相

● 二代測序技術(shù)速率限制因素

• 庫的構(gòu)建
• 生物信息學，海量數(shù)據(jù)的拼接

8.2.3 第三代測序：單分子測序技術(shù)

• 一系列錨定的 DNA 聚合酶分子芯片
• 結(jié)合模板鏈+引物

● Heliscope 一循環(huán)添加堿基 (similar to Solexa)

• HeliScope的主要錯誤在于堿基缺失，可以通過使模板鏈變性并去除、對新合成鏈二次測序來提高準確性。

● Pacific Biosciences (PACBIO RS) 單分子實時測序系統(tǒng) (SMRT)

• Pacific Biosciences
  實時監(jiān)測，錨定的 DNA 聚合酶
  能檢測 DNA 修飾 (i.e. methylation)
• 不需要常規(guī)的 PCR 擴增步驟，假陽性率大大減少；
• 利用單個 DNA 聚合酶對天然 DNA 的合成進行大規(guī)模平行的、連續(xù)的實時觀察，更易發(fā)現(xiàn)稀有變異；
• 測序同時獲得動力學信息，對 DNA 甲基化等堿基變化直接分析；
• 序列數(shù)據(jù)在幾分鐘之內(nèi)就能產(chǎn)生并能實時觀察，對于傳染病監(jiān)控和分子病理學尤為重要。
• 測序速度快（體現(xiàn) DNA 聚合酶自身的反應速度）
• 測序片段長（DNA 聚合酶的延續(xù)性）
• RNA 測序成為可能（固定逆轉(zhuǎn)錄酶）
• DNA 序列甲基化的檢測（甲基化修飾影響堿基摻入時間，改變信號持續(xù)時間或信號間隔時間）

8.3 功能調(diào)控與檢測技術(shù)（沒講）

研究蛋白質(zhì)間相互作用、蛋白質(zhì)-DNA 相互作用。
科研人員還可以在活細胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，為認識信號轉(zhuǎn)導通路、蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工等提供了豐富的技術(shù)支持。

8.3.1 表達量

8.3.2 酵母單雜、雙雜交系統(tǒng)

8.3.3 各類相互作用技術(shù)

8.3.4 標記和熒光成像技術(shù)

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總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的【中科院】分子生物学-朱玉贤第四版-笔记-第11-12讲 基因功能研究技术的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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