當(dāng)前位置：首頁(yè) > 编程资源 > 编程问答 >内容正文

编程问答

ISME：华中农大李霞组发现大豆根际微生物组变化与根瘤菌共生效率的关系

發(fā)布時(shí)間：2023/12/8 编程问答 50 豆豆

生活随笔收集整理的這篇文章主要介紹了 ISME：华中农大李霞组发现大豆根际微生物组变化与根瘤菌共生效率的关系小編覺得挺不錯(cuò)的,現(xiàn)在分享給大家,幫大家做個(gè)參考.

文章目錄

大豆根際微生物群落的變化及其與根瘤菌共生效率的關(guān)系
- 寫在前面
- 摘要
- 背景
- 結(jié)果
- - 不同類型土壤中大豆根際區(qū)微生物組的組成和多樣性
  - 圖 1 三種類型土壤中大豆根際區(qū)微生物組的α和β多樣性
  - 不同根際取樣部位的微生物共現(xiàn)和相互作用網(wǎng)絡(luò)
  - 圖 2 不同隔間區(qū)域中的微生物相互作用網(wǎng)絡(luò)
  - 大豆根瘤中根瘤菌的組成取決于土壤條件
  - 圖 3 土壤處理與根際和根瘤中的根瘤菌組成的關(guān)系
  - 根際微生物組與根瘤菌的結(jié)瘤有關(guān)
  - 圖 4 根際微生物群落結(jié)構(gòu)與中華根瘤菌和慢生根瘤菌的結(jié)瘤有關(guān)
  - 在體外芽孢桿菌對(duì)根瘤菌生長(zhǎng)的不同作用
  - 圖 5 芽孢桿菌對(duì)根瘤菌生長(zhǎng)和結(jié)瘤的影響
  - 芽孢桿菌可緩解鹽堿條件對(duì)溫室中CCBAU45436結(jié)瘤表型的影響
  - 芽孢桿菌影響中華根瘤菌在根瘤中的定殖效率
  - 圖 6 芽孢桿菌對(duì)根瘤中根瘤菌定殖的影響
- 討論
- 材料與方法
- - 土壤類型和根瘤菌
  - 溫室實(shí)驗(yàn)
  - 16S rRNA基因樣品的制備，測(cè)序和分析
  - 微生物的篩選與鑒定
  - 互作試驗(yàn)
  - 結(jié)瘤試驗(yàn)
  - 統(tǒng)計(jì)分析
- Reference
- 通訊作者簡(jiǎn)介
- 猜你喜歡
- 寫在后面

大豆根際微生物群落的變化及其與根瘤菌共生效率的關(guān)系

Variation in rhizosphere microbial communities and its association with the symbiotic efficiency of rhizobia in soybean

The ISME Journal [IF:9.493]

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-020-0648-9

發(fā)表日期：2020-04-27

第一作者：Qin Han¹

通訊作者：Yang Bai(白洋)(ybai@genetics.ac.cn)², Wenfeng Chen(chenwf@cau.edu.cn)³, Xia Li(李霞)(xli@mail.hzau.edu.cn)¹

合作作者：Qun Ma, Yong Chen, Bing Tian, Lanxi Xu

主要單位：

¹華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, No. 1 Shizishan Road, Hongshan District, Wuhan 430070 Hubei,
China)

²中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所植物基因組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Genetics and Developmental Biology, The Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

²中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences and Rhizobium Research Center, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

寫在前面

關(guān)鍵字：中華根瘤菌，慢生根瘤菌，芽孢桿菌，根際微生物組，共生效率，鹽堿條件

點(diǎn)評(píng)：大豆根際具有特定的微生物群落，但是尚未對(duì)這些微生物是否影響根瘤菌結(jié)瘤進(jìn)行深入研究，該研究報(bào)道芽孢桿菌和根瘤菌之間相互作用關(guān)系以及芽孢桿菌對(duì)脅迫下根瘤菌-豆類共生結(jié)瘤的影響的研究。為了了解大豆植物、根瘤菌和土著微生物群之間的相互作用，作者研究了三種土壤類型(pH不同)中根際區(qū)域微生物群的組成和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，鑒定了與根瘤菌結(jié)瘤相關(guān)的微生物，分離了候選菌株，并最終探討了它們?cè)诟鼋Y(jié)瘤中的作用。本研究的發(fā)現(xiàn)為土著微生物群在根瘤菌適應(yīng)其環(huán)境和調(diào)節(jié)根瘤菌共生效率中的作用提供了第一個(gè)證據(jù)。總而言之，本研究發(fā)現(xiàn)表明，根際微生物群在根瘤菌-大豆共生和植物適應(yīng)脅迫環(huán)境中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

摘要

根瘤菌-豆類共生是植物-微生物共生的一種重要類型；但是，這種關(guān)聯(lián)的建立很復(fù)雜，并可能受到許多因素的影響。大豆根際具有特定的微生物群落，但是尚未對(duì)這些微生物是否影響根瘤菌結(jié)瘤進(jìn)行深入研究。在這里，我們分析了三種土壤類型中大豆根際區(qū)域微生物群的組成和相互關(guān)系。首先，我們發(fā)現(xiàn)在不同土壤中的大豆根際群落組成存在顯著差異，并檢查了根瘤菌與其他根際細(xì)菌之間的聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)。其次，我們發(fā)現(xiàn)一些根際微生物與根瘤中的慢生根瘤菌和中華根瘤菌的組成有關(guān)。我們從堿性土壤中培養(yǎng)了278個(gè)候選芽孢桿菌分離株。最后，交互作用和結(jié)瘤試驗(yàn)表明蠟狀芽孢桿菌組分別特異性地促進(jìn)和抑制了中華根瘤菌和慢生根瘤菌的生長(zhǎng)，并緩解了鹽堿條件對(duì)中華根瘤菌的結(jié)瘤及其在瘤中定殖的影響。我們的發(fā)現(xiàn)證明了細(xì)菌菌群在塑造大豆根瘤菌-宿主相互作用中的關(guān)鍵作用，并為通過(guò)使用合成細(xì)菌群落提高這種共生體系的共生效率提供了框架。

背景

氮是所有生物的重要元素。它是通過(guò)固氮從二氮分子(N₂)中提取的，氮?dú)庹嫉厍虼髿獾?8％。因此，固氮對(duì)于生命至關(guān)重要。固氮主要通過(guò)固氮細(xì)菌和古細(xì)菌在土壤中進(jìn)行。在固氮細(xì)菌中，根瘤菌可作為腐生菌生活在土壤中，也可作為共生菌生活在其寄主豆科植物的根瘤中。在這些根瘤中，根瘤菌固定了大氣中的氮以供宿主使用，而宿主則通過(guò)光合作用為根瘤菌提供碳。根瘤菌和豆科植物之間的這種共生是植物與微生物共生的一個(gè)極好的例子，不僅對(duì)豆科植物(例如大豆，鷹嘴豆，豌豆，普通豆和苜蓿)有益，而且對(duì)全球氮循環(huán)也有益。

根瘤菌-豆類共生的基礎(chǔ)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括多個(gè)階段，包括豆科植物根的根瘤菌侵染，根瘤發(fā)育，根瘤功能和根瘤衰老。雖然根瘤菌與豆科植物的相互作用已被廣泛認(rèn)識(shí)，但這種互惠共生關(guān)系具有高度的特異性和廣泛的多樣性。例如，豆科根瘤菌 bv. trifolii只能感染三葉草物種(Trifolium spp.)，而Sinorhizobium fredii NGR234表現(xiàn)出廣泛的宿主范圍，可以感染112個(gè)豆科屬。根瘤菌對(duì)豆科宿主根細(xì)胞的選擇性識(shí)別和侵染是成功建立共生的前提。對(duì)于給定的宿主，根瘤菌的成功侵染不僅取決于不同根瘤菌物種的競(jìng)爭(zhēng)能力，還取決于根瘤菌應(yīng)對(duì)各種波動(dòng)環(huán)境因素(包括土壤特性和pH值)的能力。

在大豆中，中華根瘤菌(Ensifer)和慢生根瘤菌是兩個(gè)主要的微共生類群，它們的結(jié)瘤能力不同。值得注意的是，這些根瘤菌在具有不同pH值的土壤中相互競(jìng)爭(zhēng)。在酸性土壤中，大豆cv. Williams根瘤菌中的慢生根瘤菌菌株如 Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110占主導(dǎo)地位；相反地，在堿性土壤中，大豆根瘤中以中華根瘤菌菌株為主。有人提出，這些根瘤菌對(duì)不同pH值土壤的適應(yīng)性是由慢生根瘤菌和中華根瘤菌介導(dǎo)的大豆根瘤的生物地理模式的基礎(chǔ)。的確，中華根瘤菌種類在堿性鹽漬土中占主導(dǎo)地位，而慢生根瘤菌在中性至酸性土壤中占主導(dǎo)地位。

土壤中還含有數(shù)十億種的微生物，包括細(xì)菌和真菌。根瘤菌可能與其潛在宿主豆科植物的根際或土壤中的這些微生物競(jìng)爭(zhēng)，從而建立共生關(guān)系。據(jù)報(bào)道，豆科植物，例如 L. japonicum, M. truncatula和大豆，在根際或根部的細(xì)菌裝配的建立中起著至關(guān)重要的作用，而根瘤菌和豆類之間的共生直接影響著這兩個(gè)區(qū)域中微生物的結(jié)構(gòu)。構(gòu)成常見結(jié)瘤信號(hào)通路或介導(dǎo)類黃酮和硝酸鹽改變的基因(例如，Nod因子受體5，Nodule起始和Lotus組氨酸激酶1)功能的喪失會(huì)影響豆科植物根瘤菌的侵染，從而重塑根際微生物群落。植物與各種微生物建立密切的聯(lián)系，形成復(fù)雜的群落，這些群落在宿主植物和環(huán)境之間會(huì)有所不同，這種平衡的改變可能會(huì)影響宿主的生長(zhǎng)或?qū)е录膊　４罅孔C據(jù)表明，與根相關(guān)的微生物組可以影響植物與病原體相互作用的結(jié)果。因此，我們推測(cè)，根瘤菌-豆類共生體也可能受到生活在土壤中或棲息在植物生態(tài)位中的共生微生物的影響。此外，在大豆中，某些特定的官能團(tuán)在根際中比在土體土壤中更具代表性，并涉及包括氮，鐵，磷和鉀的代謝在內(nèi)的功能，但尚未確定它們是否影響宿主-根瘤菌的相互作用。

在這項(xiàng)研究中，為了了解大豆植物，根瘤菌和當(dāng)?shù)匚⑸锶褐g的相互作用，我們研究了三種土壤類型中根際區(qū)域微生物群的組成和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。此外，我們鑒定了與根瘤菌結(jié)瘤相關(guān)的微生物，分離了候選菌株，并最終探討了它們?cè)诟鼋Y(jié)瘤中的作用。我們的發(fā)現(xiàn)為土著微生物群在根瘤菌適應(yīng)其環(huán)境和調(diào)節(jié)根瘤菌共生效率中的作用提供了第一個(gè)證據(jù)。

結(jié)果

不同類型土壤中大豆根際區(qū)微生物組的組成和多樣性

Composition and diversity of the soybean rhizocompartment microbiota in different types of soils

為了研究在不同土壤中生長(zhǎng)的大豆微生物的組成和多樣性，我們從武漢(湖北省)，四平(黑龍江省)和欒城縣(河北省)三個(gè)主要大豆產(chǎn)區(qū)收集了三種不同類型的土壤，這些土壤的pH值分別為5.63(酸性)，7.2(中性)和8.23(堿性)。因此，我們按照Bulgarelli等人和Xiao等人的描述收集了根，根際，根瘤和土體土壤樣品。通過(guò)PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的V5-V7區(qū)，并在Illumina MiSeq平臺(tái)上測(cè)序。總共從48個(gè)樣本中獲得了1,797,926個(gè)高質(zhì)量的非嵌合序列，每個(gè)樣本的中值序列值為37,457(范圍為30,032-44,608)。補(bǔ)充Fig. S2a中顯示了基于OTU編號(hào)的分隔樣品的稀疏曲線。測(cè)序數(shù)據(jù)被稀疏到在單個(gè)樣品中觀察到的最低數(shù)量的讀長(zhǎng)，并鑒定出3107個(gè)細(xì)菌OTU。補(bǔ)充表S5中顯示了高通量測(cè)序結(jié)果的一般特征以及所有級(jí)別的分類單元編號(hào)。Good’s coverage對(duì)于觀測(cè)到的OTU的覆蓋率為98.65±0.08％(mean?±?s.e.m.)，除了土體土壤和根際樣品之間的差異外，其他隔室樣品之間的Chao1指數(shù)值存在顯著差異。

對(duì)于土體土壤，細(xì)菌群落組成在不同土壤中差異很大。酸性土壤中主要微生物菌群的相對(duì)豐度(包括酸桿菌門，變形菌門和綠彎菌門)顯著高于中性(Ne)或堿性(Al)土壤，而中性(Ne)和堿性(Al)土壤中放線菌門、厚壁菌門和芽孢桿菌比酸性(Ac)土壤中的豐富(FDR矯正P<0.05，Kruskal–Wallis H檢驗(yàn))。三種土壤中的變形菌門和放線菌門的差異在根際樣品中更大，但在根和根瘤樣品中沒有觀察到。在科水平上，還觀察到了不同土壤類型的根際取樣部位細(xì)菌組成的差異，并且該趨勢(shì)與門水平上的趨勢(shì)一致。在前十個(gè)科中，土體土壤樣品中的所有物種，根際樣品中的六個(gè)物種，根樣品中的五個(gè)物種以及根瘤樣品中的只有兩個(gè)物種顯著不同，分別屬于根瘤菌科和慢生根瘤菌科。阿爾法多樣性分析(Shannon指數(shù))表明，在三種土壤中，大豆根和根瘤微生物群落之間的差異在被測(cè)土壤中不如在根際或土體土壤樣品中明顯(圖.1a)。Bray–Curtis距離的PCoA(β多樣性)表明，三種土壤中的土體土壤(圓形)，根際(正方形)和根(三角形)微生物群表現(xiàn)出清晰的分離(圖.1b)。對(duì)于根瘤取樣部位，酸性(Ac)和中性(Ne)土壤樣品聚集在一起，但與堿性(Al)土壤樣品完全分開。基于Bray-Curtis和加權(quán)UniFrac距離的PERMANOVA證實(shí)，當(dāng)在三種土壤中生長(zhǎng)時(shí)，大豆三個(gè)根際取樣部位中的微生物群落都具有顯著差異(P<0.01)。

圖 1 三種類型土壤中大豆根際區(qū)微生物組的α和β多樣性

Alpha and beta-diversity of the soybean rhizocompartment microbiota in three types of soils

a 測(cè)量酸性土壤(Ac)，中性土壤(Ne)和堿性土壤(Al)中不同取樣部分微生物群落的α-多樣性(Shannon指數(shù))。通過(guò)配對(duì)的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并以星號(hào)表示顯著性，其中* P <0.05。數(shù)據(jù)以中值±SDs(n=4)表示。

b 基于Bray–Curtis距離的PCoA表明，土壤類型是根際和根部細(xì)菌群落變異的主要來(lái)源。N=108。通過(guò)土壤類型的聚類顯著性由Adonis確定(Pr(>F)= 0.001)。每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于一個(gè)按土壤類型著色的不同樣本，每個(gè)取樣部位用不同的形狀表示。

不同根際取樣部位的微生物共現(xiàn)和相互作用網(wǎng)絡(luò)

Microbial cooccurrence and interaction networks in the different rhizocompartments

不同微生物菌株之間的相互作用是種群結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的主要驅(qū)動(dòng)因素之一，因?yàn)槲⑸锟梢韵嗷ズ献骰虮舜伺懦狻Ｒ虼?#xff0c;我們接下來(lái)使用Networkx軟件分析不同隔間區(qū)域中的交互網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)屬在三種不同土壤類型的樣本中的發(fā)生模式，計(jì)算屬之間的Spearman相關(guān)值。我們的結(jié)果顯示，根際區(qū)隔微生物群內(nèi)的節(jié)點(diǎn)連接性很高。在屬水平前30種細(xì)菌的分析中，土體土壤中有202種相關(guān)性(圖2a)，根際有184種相關(guān)性(圖2b)，根部有90種相關(guān)性(圖2c)，根瘤樣本中有185個(gè)相關(guān)性(圖2d)。這些結(jié)果表明，與土體土壤相比，根際和根部的相互作用網(wǎng)絡(luò)相對(duì)簡(jiǎn)單。在根瘤中，細(xì)菌之間的相關(guān)性增加，而微生物網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性下降。除了慢生根瘤菌與中華根瘤菌(?0.847637)，Rhodococcus (?0.623598)，和 unclassified_f__Alcaligenaceae (?0.770069)呈負(fù)相關(guān)外，連通性表明所有其他屬均呈正相關(guān)，這表明這些類群可以與大豆根瘤中的根瘤菌共現(xiàn)，并且不會(huì)彼此排斥。此外，我們發(fā)現(xiàn)在根際樣品中也觀察到了慢生根瘤菌和中華根瘤菌之間的負(fù)相關(guān)性(-0.70403)。此外，慢生根瘤菌和中華根瘤菌分別與另外14個(gè)和13個(gè)不同的根際屬(正和負(fù))相關(guān)(圖2b)，這可能影響這兩種類型的根瘤菌的結(jié)瘤。

圖 2 不同隔間區(qū)域中的微生物相互作用網(wǎng)絡(luò)

Microbial interaction networks in the different compartments

土體土壤(a)，根際(b)，根(c)和根瘤(d)中屬水平(前30位)的優(yōu)勢(shì)菌群相互作用網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)的大小表示OTU的豐度，不同的顏色表示在門水平的相應(yīng)物種分類分配。邊顏色表示正(紅色)和負(fù)(綠色)相關(guān)。邊寬度表示相關(guān)值。僅顯著相關(guān)的(r>0.6；P<0.05)被顯示出來(lái)。

大豆根瘤中根瘤菌的組成取決于土壤條件

The composition of rhizobia in soybean nodules is soil condition-dependent

在天然酸性或中性土壤的根瘤群落中(圖3a–I)，慢生根瘤菌是最豐富的菌屬，約占總豐度的99.97％。相比之下，中華根瘤菌在來(lái)自堿性土壤的根瘤中占優(yōu)勢(shì)(98.56％)，而在來(lái)自酸性土壤(0.081％)或中性土壤的根瘤中的卻占極少比例(0.007％)(圖.3b–I)。為了進(jìn)一步探討土壤因素對(duì)根瘤中根瘤菌組成的影響，我們對(duì)種植的土壤進(jìn)行了人工干預(yù)。首先，我們通過(guò)添加石灰(pH 8.2)來(lái)改變酸性或中性土壤的pH(圖3a–II)；第二，我們將酸性或中性土壤與堿性土壤(1：1；w/w)混合(圖3a–III)；再者，在種植植物之前，我們將土壤在80°C條件下加熱20分鐘(圖3a–IV)。讓滅菌的大豆種子在這些土壤中生長(zhǎng)28天，并如上所述收集根際土壤(28個(gè)樣品)和根瘤(28個(gè)樣品)。這56個(gè)樣品的擴(kuò)增和測(cè)序產(chǎn)生了2,703,009個(gè)高質(zhì)量序列(每個(gè)樣本平均48,268且范圍為30,585–95,823個(gè)序列)。補(bǔ)充圖S7顯示了基于OTU數(shù)量的來(lái)自兩個(gè)取樣區(qū)域樣品的稀釋曲線。使用與上述相同的標(biāo)準(zhǔn)將序列聚類到OTU中，產(chǎn)生2830個(gè)微生物OTU，兩個(gè)取樣部位的Chao1和Shannon指數(shù)顯著不同(FDR矯正P <0.001，Wilcoxon秩和檢驗(yàn))。

圖 3 土壤處理與根際和根瘤中的根瘤菌組成的關(guān)系

Relationship between soil treatment and composition of rhizobia in the rhizosphere and nodules

a 土壤處理的示意圖。酸性土壤 (Ac)，中性土壤(Ne)，堿性土壤(Al)，酸性土壤加石灰(Ac8)，中性土壤加石灰(Ne8)，加熱的酸性土壤(HAc)，中性土壤(HNe)，堿性土壤(HAl)，用50％(w/w)酸性土壤(Ac/Al)或中性土壤(Ne/Al)修飾的堿性土壤。

b 圖a所示土壤中種植的植物根瘤中的慢生根瘤菌和中華根瘤菌的相對(duì)豐度。I，II，III和IV分別代表普通土壤，pH值變化，混合土壤和熱處理的土壤。紫色代表慢生根瘤菌。藍(lán)色代表中華根瘤菌。星號(hào)表明，中華根瘤菌的相對(duì)豐度要高于慢生根瘤菌。

改變酸性或中性土壤的pH值以創(chuàng)造堿性條件后，根瘤中中華根瘤菌的豐度沒有增加(圖.3b–II)。這表明，除了土壤的pH值外，土壤中的其他因素也可能影響根瘤中根瘤菌的組成。當(dāng)大豆在酸性堿性混合土壤(pH 6.93)中生長(zhǎng)時(shí)，中華根瘤菌的相對(duì)根瘤豐度(86.56％)超過(guò)了慢性根瘤菌，而在中性堿性混合土壤(pH 7.71)中，中華根瘤菌的根瘤豐度卻沒有顯著變化(圖.3b–III)。進(jìn)一步的熱處理實(shí)驗(yàn)表明，在熱處理的中性土壤中，根瘤中中華根瘤菌的相對(duì)豐度顯著增加(54.64％)。但是，在經(jīng)過(guò)加熱處理的酸性土壤中生長(zhǎng)的大豆植株中并未發(fā)現(xiàn)這種變化(圖. 3b–IV)。這些結(jié)果共同表明，種植土壤對(duì)根瘤中根瘤菌組成的影響是復(fù)雜的，并不僅僅取決于土壤pH。

根際微生物組與根瘤菌的結(jié)瘤有關(guān)

Rhizosphere microbiomes were associated with nodulation of rhizobia

為了確定根瘤中根瘤菌組成的變化是否與根際細(xì)菌有關(guān)，我們分析了十個(gè)根際樣品的微生物群落組成，并進(jìn)行了聚類分析。熱圖分析的層次聚類結(jié)果根據(jù)優(yōu)勢(shì)門將十個(gè)根際樣品分為三個(gè)主要簇，這三個(gè)簇在門上具有不同的細(xì)菌組合(圖. 4a)。這些聚類通過(guò)基于Bray–Curtis距離和PERMANOVA的PCoA確認(rèn)(P <0.05)，并且在十種土壤處理中觀察到明顯的聚類。主變異軸(解釋總變異的37.9%)將聚類3(Ac, Ac8, and HAc)和聚類2(HNe and HAl)同聚類1(Ne, Ne8, Al, Ac/Al, Ne/Al, HNe, and HAl)分開，而次變異軸(解釋總變異量的20.6%)將聚類2與聚類3分開(圖. 4b)。

圖 4 根際微生物群落結(jié)構(gòu)與中華根瘤菌和慢生根瘤菌的結(jié)瘤有關(guān)

The rhizosphere microbial community structure was associated with the nodulation of Bradyrhizobium and Sinorhizobium

a門水平不同根際樣品的細(xì)菌微生物的組成和聚類。

b土壤中生長(zhǎng)的大豆幼苗的根際微生物組基于Bray–Curtis距離的PCoA分析如圖3a所示；n=40。聚類的顯著性由Adonis(Pr(>F)=0.001)確定。酸性土壤(Ac)，中性土壤(Ne)，堿性土壤(Al)，酸性土壤加石灰(Ac8)和中性土壤加石灰(Ne8)，用50％(w/w)酸性土壤(Ac/Al)或中性土壤(Ne/Al)修飾的堿性土壤和加熱的酸性土壤(HAc)，中性土壤(HNe)，堿性土壤(HAl)。

c線性判別分析(LDA)結(jié)合效應(yīng)尺度的測(cè)量，確定了b中數(shù)據(jù)的顯著豐富性。富集在I組(紫色)和II組(藍(lán)色)的分類群分別用LDA分?jǐn)?shù)表示。僅顯示LDA值大于3.5(P <0.05)的分類群。

接下來(lái)，我們根據(jù)根瘤中根瘤菌的組成 (圖. 3b)將這10種處理分為I組 (Al, Ac/Al, HNe, 和
HAl)和II組(Ne, Ne8, Ne/Al, Ac, HAc, and Ac8)，并利用線性判別分析效果尺度(LEfSe)算法。結(jié)果表明，八個(gè)和五個(gè)科(LDA log得分閾值>3.5和P<0.05)最有可能分別解釋了I組和II組之間的差異。在第一組中，Comamonadaceae的LDA得分最高(5.16)，其次是Pseudomonadaceae (4.89)， Alicyclobacillaceae (4.09)， Paenibacillaceae (4.7)，Rhizobiaceae (3.99)，Bacillaceae (3.98)，和Microbacteriaceae (3.73)，其被確定為I組的主要關(guān)鍵科，可能與中華根瘤菌的結(jié)瘤有關(guān)。相比之下，第二組中的指示細(xì)菌科聚集在Micrococcaceae (4.29)，Intrasporangiaceae (3.90)，norank_o__Gaiellales (3.77)，norank_o__SC_I_84 (3.68)，and norank_p__Saccharibacteria (3.52)，這可能與慢生根瘤菌的結(jié)瘤有關(guān)。

在體外芽孢桿菌對(duì)根瘤菌生長(zhǎng)的不同作用

Differential effects of Bacillus on the growth of rhizobia in vitro

在上述指示的科中，Bacillaceae是植物-微生物相互作用中的有益微生物，已在許多植物根際中被檢測(cè)到，并且因其具有植物抗病性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的特性而聞名。Bacillaceae(占第一組OTUs的4.30%)在堿性根際樣品中含量很高，而Bacillus與根際樣品(圖.2b)中的中華根瘤菌呈顯著正相關(guān)(r=0.714537)，這一事實(shí)促使我們探索Bacillus在根瘤菌結(jié)瘤中的可能機(jī)制。為此，我們從經(jīng)熱處理的堿性土壤中分離出候選Bacillus菌株。首先，選擇了278個(gè)候選Bacillus分離株，并在YMA培養(yǎng)基(0.7％瓊脂)上檢查了它們與S. fredii CCBAU45436的相互作用。結(jié)果表明，一組具有相似形態(tài)的分離株(?12.6％)顯著促進(jìn)了S. fredii CCBAU45436的生長(zhǎng)。其余測(cè)試菌株對(duì)CCBAU45436的生長(zhǎng)幾乎沒有影響。通過(guò)基于16S rRNA的方法，三個(gè)具有明顯促進(jìn)作用的代表性分離株(B-9，B-11和B-13)被鑒定為蠟狀芽孢桿菌組(屬于OTU1511)。為了在物種水平上進(jìn)一步鑒定這些菌株，我們通過(guò)Illumina Hiseq平臺(tái)進(jìn)行了基因組測(cè)序。根據(jù)它們的平均核苷酸同一性(ANI)值，將這三個(gè)菌株重新分類為Bacillus albus B-9(95.61% ANI to B. albus N35–10–2)，B. cereus B-11(97.98% ANI to B. cereus ATCC 14579)和B. albus B-13(98.26% ANI to B. albus N35–10–2)。

當(dāng)將CCBAU45436和3個(gè)Bacillus菌株在YMA培養(yǎng)基上以不同距離(0.6或1.2 cm)共培養(yǎng)4天時(shí)，S. fredii CCBAU45436的菌落直徑(1.14 cm)(距Bacillus)在0.6 cm處明顯大于距離1.2 cm的菌落(0.91 cm)(圖5a，n = 12，P <0.0001，非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn))。更有趣的是，當(dāng)B. diazoefficiens USDA110和Bacillus在YMA培養(yǎng)基上共培養(yǎng)時(shí)，與Bacillus相鄰的USDA110的生長(zhǎng)受到明顯抑制(圖5b)，變成橢圓形(圖5c)。未觀察到Pseudomonas菌株(也從堿性土壤中分離)對(duì)CCBAU45436有明顯的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，對(duì)USDA110有明顯的抑制作用。此外，Bacillus還刺激了γ射線滅菌的堿性土壤中的S. fredii CCBAU45436的生長(zhǎng)，但抑制了B. diazoefficiens USDA110的生長(zhǎng)。總體而言，這些結(jié)果表明*B. cereus***組可以分別特異性地促進(jìn)和抑制CCBAU45436和USDA110的生長(zhǎng)，再次表明***Bacillus*屬與根瘤菌相互作用。

圖 5 芽孢桿菌對(duì)根瘤菌生長(zhǎng)和結(jié)瘤的影響

Effect of Bacillus on the growth and nodulation of rhizobia

a 在YMA平板上，將芽孢桿菌菌落接種在S. fredii CCBAU45436菌落旁邊，距離為1.2 cm或0.6 cm。

b 將芽孢桿菌菌落接種在B. diazoefficiens USDA110菌落旁邊，距離為1.2 cm或0.6 cm。

c B. diazoefficiens USDA110的反向菌落接種在 a 中的Bacillus B-9附近。結(jié)果代表具有相似結(jié)果的三個(gè)重復(fù)樣品之一。比例尺代表2毫米。

d 在對(duì)照條件下，用水或芽孢桿菌處理的CCBAU45436或USDA110接種植物的根瘤數(shù)。

e 在鹽堿條件下用H₂O或芽孢桿菌處理過(guò)的CCBAU45436或USDA110接種植物的根瘤數(shù)(25 mM NaHCO₃ +75 mM NaCl)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行，顯著性用星號(hào)表示，其中*表示P<0.05。數(shù)據(jù)表示為中值±SD(n＝4)。

芽孢桿菌可緩解鹽堿條件對(duì)溫室中CCBAU45436結(jié)瘤表型的影響

Bacillus alleviates the effect of saline–alkali conditions on the nodulation phenotype of CCBAU45436 in the greenhouse

接下來(lái)，我們研究了芽孢桿菌對(duì)溫室中CCBAU45436和USDA110結(jié)瘤能力的影響，并添加不同濃度的過(guò)碳酸鈉和氯化鈉到蛭石上，以模擬鹽堿條件。在對(duì)照條件下(pH 7)，USDA110接種的大豆的根瘤數(shù)要多于CCBAU45436接種的植物，但差異不顯著。隨著pH(碳酸氫根離子濃度)的增加，接種根瘤菌的兩種植物中的根瘤數(shù)均增加，但接種CCBAU45436的植物中的根瘤數(shù)比對(duì)照條件下的增加更為明顯。pH值為8(25 mM NaHCO₃ + 75 mM NaCl)時(shí)，最大的結(jié)瘤數(shù)(165)與較小的尺寸和葉片萎黃有關(guān)。對(duì)于USDA110接種的植物，pH=8.5時(shí)(50mM NaHCO₃+50mM NaCl) ，結(jié)瘤數(shù)最多(128)，而且萎黃病的嚴(yán)重程度不及接種CCBAU45436的植物。

在pH 7(對(duì)照)條件下，芽孢桿菌處理不會(huì)顯著影響接種CCBAU45436或USDA110的植物的根瘤數(shù)(圖. 5d)；與之形成鮮明對(duì)比的是，芽孢桿菌處理(B-9和B-11)恢復(fù)了接種CCBAU45436的植株的根瘤表型(減少的根瘤數(shù))，而芽孢桿菌在pH=8(25 mM NaHCO₃ + 75 mM NaCl)條件下不影響USDA110接種的植株的根瘤數(shù)或大小(圖. 5e)。
總之，這些結(jié)果表明CCBAU45436-大豆共生體比USDA110-大豆共生體對(duì)pH更敏感，并且芽孢桿菌可以減輕pH對(duì)CCBAU45436-大豆共生的抑制作用。

芽孢桿菌影響中華根瘤菌在根瘤中的定殖效率

Bacillus affects colonization efficiency of Sinorhizobium in nodules

為了進(jìn)一步研究芽孢桿菌對(duì)大豆根瘤中的慢生根瘤菌和中華根瘤菌定殖的作用，我們進(jìn)行了根瘤菌混合接種實(shí)驗(yàn)。在鹽堿溶液(pH 8)條件下，將三種慢生根瘤菌和三種中華根瘤菌菌株共接種到有或沒有芽孢桿菌的大豆植株上(圖. 6a)。中華根瘤菌和慢生根瘤菌分別對(duì)堿和酸條件有更強(qiáng)的抵抗力，這與以前的研究一致。接種后28天，根瘤中的中華根瘤菌或慢生根瘤菌的種群分別以mlr6601或nodC的基因拷貝表示，并使用屬特異性引物通過(guò)qPCR進(jìn)行定量。使用CCBAU45436和USDA110基因組DNA的系列稀釋液獲得各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣，在對(duì)照條件下，有無(wú)芽孢桿菌處理的根瘤中，中華根瘤菌或慢生根瘤菌(基因拷貝)的種群數(shù)量也沒有顯著差異(圖. 6b)。鹽堿處理后，根瘤中mlr6601(中華根瘤菌)的基因拷貝略有增加(0.003增加到3.617×10⁵)，但與芽孢桿菌共接種后，其顯著增加(增加到13.252×10⁵)(圖. 6b，c)。接種芽孢桿菌前后，nodC(慢生根瘤菌)的基因拷貝數(shù)也減少，但差異不顯著(圖. 6c)。此外，我們用特異引物（OPL-114F-lipo和OPL-114R-lipo）擴(kuò)增了根瘤樣品中芽孢桿菌的標(biāo)記基因，未檢測(cè)到條帶(數(shù)據(jù)未顯示)，表明接種的芽孢桿菌沒有進(jìn)入根瘤。總之，這些結(jié)果表明，芽孢桿菌可能以依賴于堿性條件的方式間接地促進(jìn)了中華根瘤菌在根瘤中的定殖。

圖 6 芽孢桿菌對(duì)根瘤中根瘤菌定殖的影響

Effect of Bacillus on the colonization of rhizobia in nodules

a 混合接種實(shí)驗(yàn)的示意圖，顯示了種植，接種和定量檢測(cè)方法。將三天大的植物移植到對(duì)照或鹽堿處理的蛭石中，然后用混合的根瘤菌或含芽孢桿菌的混合根瘤菌接種。28天后，提取根瘤中的類細(xì)菌DNA，通過(guò)qPCR定量?jī)煞N根瘤菌的濃度，并重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn)。

b 在對(duì)照條件下，中華根瘤菌或慢生根瘤菌的種群數(shù)量。

c 在鹽堿條件下，中華根瘤菌或慢生根瘤菌的種群數(shù)量。Mix-R表示六株根瘤菌。用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)分析了Mix-R和Mix-R+Bacillus處理的qPCR結(jié)果(n=4，ns不顯著；* P<0.05)。每個(gè)圖的柱狀圖表示中位數(shù)，并在適當(dāng)?shù)奈恢昧谐鰯?shù)值以便于清晰顯示。

討論

成功的共生體受根瘤菌及其豆類宿主的共同調(diào)節(jié)；此外，給定宿主中根瘤菌的結(jié)瘤率是可變的，并且受環(huán)境因素和共生根瘤菌的影響。一個(gè)眾所周知的例子是，在不同pH值的土壤種植的大豆中，中華根瘤菌和慢生根瘤菌的結(jié)瘤率存在很大差異；中華根瘤菌和慢生根瘤菌的pH耐受性差異可能解釋了這些根瘤菌的地理分布模式。比較基因組分析顯示，已知與堿鹽適應(yīng)有關(guān)的屬特定基因可能有助于觀察到大豆中的慢生根瘤菌和中華根瘤菌的根瘤形成的生物地理模式。在這里，我們發(fā)現(xiàn)大豆根際微生物群，特別是蠟狀芽孢桿菌類，影響中華根瘤菌和慢生根瘤菌的生長(zhǎng)，這可能影響這兩種根瘤菌的結(jié)瘤。

先前的研究表明，豆類具有核心的根際微生物組，其組成取決于宿主的基因型。我們發(fā)現(xiàn)，在三種土壤中生長(zhǎng)的大豆植物在根際比根部具有更大的微生物多樣性(圖1a)，這與大豆和苜蓿的結(jié)果相似。這些結(jié)果表明，根部的微生物群落比起根際或土壤中的更能適應(yīng)波動(dòng)的生長(zhǎng)環(huán)境，并且豆科植物在進(jìn)化過(guò)程中獲得具有招募某些可能對(duì)其生長(zhǎng)有益的微生物的能力。此外，我們發(fā)現(xiàn)根際室微生物，尤其在根際中存在明顯的相關(guān)性，包括根瘤菌與其他根際類群之間的相互作用(圖2b)，這與研究表明的在中國(guó)51個(gè)大豆田中的土體土壤和根際中的細(xì)菌子網(wǎng)絡(luò)受土壤pH值的影響最大相一致。

根瘤是根瘤菌生長(zhǎng)空間的器官，是共生固氮的場(chǎng)所。先前的研究表明，根瘤內(nèi)生菌的組成是植物物種特有的；在苜蓿中，中華根瘤菌是最主要的根瘤菌，而大豆根瘤中，中華瘤菌和慢生根瘤菌是最豐富的屬。我們發(fā)現(xiàn)在堿性土壤中中華根瘤菌是根瘤中的優(yōu)勢(shì)種，而在中性和酸性土壤中慢生根瘤菌是根瘤中的優(yōu)勢(shì)種(圖3b)。這些結(jié)果與以前的報(bào)道一致，后者表明大豆根瘤菌群落表現(xiàn)出巨大的生物地理類型，這是由當(dāng)?shù)氐臍夂蚝退蛩厮茉斓?有效鐵和土壤pH)。此外，我們發(fā)現(xiàn)根瘤中的根瘤菌組成也可能受其他根際微生物群的影響，例如芽孢桿菌科，其可能與中華根瘤菌和慢生根瘤菌的根瘤定殖有關(guān)(圖.5a，b)。

芽孢桿菌科是眾所周知的有益根際和內(nèi)生細(xì)菌，在大豆微生物群的非根際亞群落中占主導(dǎo)地位。據(jù)報(bào)道有數(shù)種芽孢桿菌菌株影響大豆結(jié)瘤，但尚不清楚芽孢桿菌在大豆結(jié)瘤中的作用。有趣的是，我們的數(shù)據(jù)顯示，從鹽堿土壤中分離的蠟狀芽孢桿菌組菌株能特異性促進(jìn)CCBAU45436的生長(zhǎng)，但會(huì)抑制USDA110的生長(zhǎng)(圖. 5a，b)，并且我們推測(cè)芽孢桿菌也可能影響根瘤菌在土壤中的分布。通過(guò)用碳酸氫鈉和氯化鈉模擬鹽堿條件，我們發(fā)現(xiàn)隨著pH的增加，即使結(jié)瘤很小，但接種CCBAU45436的植物中的結(jié)瘤數(shù)也會(huì)增加，這也可能部分解釋了為什么中華根瘤菌在堿性土壤條件下占主導(dǎo)地位。同樣，在低磷條件下，某些根瘤菌也可以誘導(dǎo)更多和較小的根瘤，因?yàn)樗鼈儗?duì)壓力相對(duì)更敏感。在正常條件下，芽孢桿菌不會(huì)影響CCBAU45436或USDA110接種植物的根瘤數(shù)。然而，芽孢桿菌處理在鹽堿條件下恢復(fù)了CCBAU45436接種大豆植株的根瘤缺陷(主要是根瘤數(shù))(圖5e)，并且也影響了中華根瘤菌在根瘤中的定殖(圖.6)。眾所周知，根相關(guān)的細(xì)菌可以減輕鹽分和堿度脅迫對(duì)植物的不利影響，因此這些根部相關(guān)的細(xì)菌可能有益于豆類中那些脅迫敏感性根瘤菌的結(jié)瘤。合作和競(jìng)爭(zhēng)的微生物相互作用是在不同的隔間中驅(qū)動(dòng)復(fù)雜的微生物組合以實(shí)現(xiàn)植物適應(yīng)性的重要的選擇力。據(jù)我們所知，該研究是第一個(gè)報(bào)道芽孢桿菌和根瘤菌之間相互作用關(guān)系以及芽孢桿菌對(duì)脅迫下根瘤菌-豆類共生結(jié)瘤的影響的研究。這些相互作用是否能在根際發(fā)生，以及芽孢桿菌如何影響鹽堿條件下的根瘤表型和根瘤菌定殖仍不可知。進(jìn)一步研究芽孢桿菌和根瘤菌之間的這種特殊相互作用，將有助于我們破譯芽孢桿菌在不同土壤條件下調(diào)節(jié)大豆根瘤中根瘤菌結(jié)瘤和定殖的分子機(jī)制。

總而言之，我們的發(fā)現(xiàn)表明，根際微生物群在根瘤菌-大豆共生和植物適應(yīng)脅迫環(huán)境中具有重要的調(diào)節(jié)作用。這些發(fā)現(xiàn)為大豆結(jié)瘤根瘤菌在田間的分布提供了新的見解并且提供了脅迫條件下大豆或其他豆科植物促進(jìn)根瘤菌形成根瘤的新方法。豆科植物的完整基因組及其微生物對(duì)應(yīng)物應(yīng)被視為是根瘤菌-豆科植物共生體的遺傳基礎(chǔ)和提高共生固氮效率的基因工程中的重要組成部分。

材料與方法

土壤類型和根瘤菌

Soil types and rhizobia

2016年秋季，從中國(guó)三個(gè)主要的大豆種植區(qū)收集了15 cm深度的實(shí)驗(yàn)土壤：湖北武漢(30°48′30N，114°36′E)，河北省欒城縣(37°94′N，114°72′E);及黑龍江省四平市(43°51′N，124°81′E)。未用大豆耕種或用草和雜草覆蓋的土壤儲(chǔ)存在室溫下的盒子中。在武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院檢測(cè)中心對(duì)樣品的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析。樣品分別代表三種類型的土壤：酸性(Ac)，堿性(Al)和中性(Ne)，并且土壤中的營(yíng)養(yǎng)元素含量不同。在以下土壤條件下確定微生物的組成和多樣性：(I)未經(jīng)處理的天然土壤(Ac，Ne和Al)；(II)熱處理過(guò)的土壤(在80°C下處理3次，每次20分鐘；HAc，HNe和HAl)；(III)用50％(w/w)堿性土壤(Ac/Al和Ne/Al)改良的酸性或中性土壤；(IV)用石灰改良的酸性或中性土壤(最終pH 8.2)(圖. 3a)。

使用了慢生根瘤菌屬(B. diazoefficiens USDA110，B.elkanii USDA76和B.japonicum 15781)和中華根瘤菌屬(S.fredii CCBAU45436，J18-31和HH103)的菌株。菌株USDA110，USDA76、15781，J18-3和CCBAU45436由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；菌株HH103獲自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)。所有菌株在胰蛋白胨酵母(TY)培養(yǎng)基上于28 °C下生長(zhǎng)3-4天，離心(4500 rpm 10 min)沉淀，并重懸于蒸餾水中。

溫室實(shí)驗(yàn)

Greenhouse experiments

用氯氣滅菌的大豆(Glycine max cv.Williams 82)種子分別在裝有上述土壤的盆(10×10cm)中生長(zhǎng)。每個(gè)盆中播有六粒大豆種子，并將其長(zhǎng)期置于溫室中(16小時(shí)光照，20°C/28°C，夜/日)。5天后，將幼苗稀疏至3-4顆 /盆，然后根據(jù)需要用自來(lái)水澆灌植物。根據(jù)Bulgarelli和Xiao的描述，在28天時(shí)收集了土體土壤，根際，根和根瘤樣品。未種植的土壤樣品用作對(duì)照(土體土壤)。每個(gè)處理重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)3到4顆幼苗。

16S rRNA基因樣品的制備，測(cè)序和分析

16S rRNA gene sample preparation, sequencing, and analysis

總共使用48個(gè)未處理的土壤樣品(12個(gè)土體土壤，12個(gè)根際，12個(gè)根和12個(gè)根瘤樣品)和56個(gè)處理土壤樣品(28個(gè)根際和28個(gè)根瘤樣品)進(jìn)行測(cè)序。使用E.Z.N.A.^?(Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA, USA)土壤DNA試劑盒提取微生物DNA。使用引物799F和1193R擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V5-V7高變區(qū)。PCR進(jìn)行如下：95°C下3分鐘；27個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為95°C下30S，55°C下30S，72°C下45S；最終72°C下10分鐘。反應(yīng)以一式三份的20-μL混合物進(jìn)行，該混合物包含5×FastPfu緩沖液4μL，2.5μmMdNTP2μL，每種引物(5μM)0.8μL，FastPfu聚合酶0.4μL和10μng的模板DNA。產(chǎn)物從2％的瓊脂糖凝膠中提取，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)進(jìn)行純化，并根據(jù)制造商的方案使用QuantiFluor?-ST(Promega, Madison, WI, USA)進(jìn)行定量。根據(jù)Majorbio Bio-Pharm Technology Co.Ltd(中國(guó)上海)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，將擴(kuò)增子以等摩爾濃度合并，并在Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina，圣地亞哥，加利福尼亞，美國(guó))上進(jìn)行雙端測(cè)序(2×300)。使用UPARSE以97％的相似性閾值聚類可操作分類單位(OTU)；使用UCHIME鑒定并除去嵌合體序列；使用RDP分類器算法比對(duì)到Silva(SSU123)16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，以70％的置信度閾值分析了每個(gè)16S rRNA序列的物種分類。用Mothur軟件計(jì)算Chao1和Shannon的alpha多樣性指數(shù)。使用Networkx軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。只有Spearman相關(guān)系數(shù)為|r|>0.6(P <0.05)才被視為指示有效的互作事件。使用R包vegan(version 2.1)進(jìn)行基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)。進(jìn)行線性判別分析和效應(yīng)尺度測(cè)量(LEfSe)分析，以LDA分?jǐn)?shù)至少為3.5尋找兩組之間的顯著差異(P<0.05)的物種分類。

微生物的篩選與鑒定

Microbe isolation and identification

為了從堿性土壤中分離出假定的芽孢桿菌，將1g土壤重懸于無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中，在150 rpm轉(zhuǎn)速下孵育30 min，然后將懸浮液在80 °C下熱處理20 min，并螺旋接種于Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基中。挑選，純化每個(gè)菌落類型的代表，通過(guò)形態(tài)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并將其在-80°C下保存在含有20％甘油的LB培養(yǎng)基中，直至進(jìn)一步使用。通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序確認(rèn)屬水平上的分離株的物種分類。基因組測(cè)序方案是由上海Majorbio Biopharm Technology Co., Ltd (中國(guó)上海)使用Illumina HiSeq 2000系統(tǒng)執(zhí)行的。使用基因組序列查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)以獲得最近鄰序列，并通過(guò)JSpeciesWS比較測(cè)序分離株的基因組距離。

互作試驗(yàn)

Interaction assay

將候選菌株接種在5ml的LB培養(yǎng)基中，并以180rpm的轉(zhuǎn)速于28℃下孵育過(guò)夜。將細(xì)菌培養(yǎng)物的OD在600nm處調(diào)節(jié)至0.5。USDA110和CCBAU45436菌株在TY培養(yǎng)基上28°C下生長(zhǎng)3-4天，在600nm下將培養(yǎng)物的OD讀數(shù)分別調(diào)整為1.0和0.5。接下來(lái)，將每個(gè)候選菌株的分離株或1.5μL懸浮液點(diǎn)在YMA平板上距B. diazoefficiens USDA110 或 S. fredii CCBAU45436 1.2厘米或0.6厘米的位置。將平板在28°C下孵育4-6天。使用Leica顯微鏡(DFC495)捕獲圖像。每種測(cè)定進(jìn)行四次重復(fù)。

結(jié)瘤試驗(yàn)

Nodulation assay

將經(jīng)氯氣滅菌的大豆種植在裝有滅菌蛭石的盆(10×10×10cm)中，生長(zhǎng)4天。將植物分別移植到新鮮蛭石上，分別加入和不加入25 mM NaHCO₃和75 mM NaCl。然后，將植物用20 mL B. diazoefficiens USDA110 或 S. fredii CCBAU45436 懸浮液(OD600?=?0.1)接種，并同時(shí)用30μmL無(wú)菌水(對(duì)照)或芽孢桿菌懸浮液(OD 600 = 0.5)處理。根據(jù)需要用弱氮營(yíng)養(yǎng)液(pH 7)給植物澆水。接種和處理28天后，確定了每株植物的結(jié)瘤數(shù)。每種處理均包括兩份幼苗的四份重復(fù)。在相同條件下重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn)。

為了進(jìn)行定殖試驗(yàn)，使大豆植物在蛭石中在與上述相似的條件下生長(zhǎng)。用20ml混合的根瘤菌混懸液(USDA110:USDA76:15781:CCBAU45436:J18–3: HH103=1:1:1:1:1:1, OD600=0.1)
共同接種植物，并用30ml的混合芽孢桿菌(3個(gè)菌株)混懸液處理(或不處理)(OD600=0.5)。根據(jù)需要用弱氮營(yíng)養(yǎng)液(pH 7)給植物澆水。接種后第28天，收集瘤子，并按照Trabelsi的描述(進(jìn)行了一些修改)，對(duì)瘤子中的慢生根瘤菌和中華根瘤菌進(jìn)行了定量。簡(jiǎn)而言之，使用E.Z.N.A.土壤DNA試劑盒(Omega Bio-Tek Inc.，美國(guó)喬治亞州諾克羅斯)，從每種處理中提取500 mg類細(xì)菌的總DNA。用BioPhotometer D30(Eppendorf)檢查每個(gè)DNA樣品的總體質(zhì)量和數(shù)量。使用Bio-Rad CFX Connect Real-Time (Bio-Rad, USA)在96孔板上進(jìn)行所有定量PCR。屬特異的引物組分別用于分析慢生根瘤菌和中華根瘤菌中的nodC和mlr6601基因。使用CCBAU45436或USDA110基因組DNA的系列稀釋液獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。從每個(gè)菌株的標(biāo)準(zhǔn)品得出的循環(huán)閾值線性回歸系數(shù)計(jì)算出慢生根瘤菌和中華根瘤菌的數(shù)量，并調(diào)整為每微升類細(xì)菌DNA溶液的基因拷貝數(shù)。每種處理均包括兩顆幼苗的四份重復(fù)。在相同條件下重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn)。

統(tǒng)計(jì)分析

Statistical analysis

圖形表示是使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA)生成的。計(jì)算數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。Kruskal–Wallis H檢驗(yàn)用于識(shí)別土壤類型之間門或科水平的顯著差異物種。進(jìn)行了配對(duì)的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以比較不同土壤類型的α多樣性。進(jìn)行了置換多元方差分析(PERMANOVA)，以測(cè)量效應(yīng)大小和beta多樣性的顯著性差異。芽孢桿菌和H₂O處理或Mix-R和Mix-R+Bacillus 處理的比較是通過(guò)非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)(GraphPad Prism)進(jìn)行的。

Reference

Qin Han,Qun Ma,Yong Chen,Bing Tian,Lanxi Xu,Yang Bai,Wenfeng Chen,Xia Li. Variation in rhizosphere microbial communities and its association with the symbiotic efficiency of rhizobia in soybean. ISME J (2020) https://doi.org/10.1038/s41396-020-0648-9

通訊作者簡(jiǎn)介

李霞教授團(tuán)隊(duì)主要以重要經(jīng)濟(jì)作物大豆為主要研究對(duì)象，運(yùn)用分子遺傳學(xué)、生理生化、細(xì)胞生物學(xué)、各種組學(xué)綜合多種手段，系統(tǒng)地研究大豆和根瘤菌識(shí)別、根瘤的形態(tài)建成及固氮效率調(diào)控的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)機(jī)制，旨在解析菌植互作和大豆共生固氮調(diào)控的分子機(jī)制，挖掘具有重要育種價(jià)值的基因和優(yōu)異等位變異。此外，我們對(duì)非生物逆境下大豆共生固氮的適應(yīng)機(jī)制非常感興趣。本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)在大豆共生固氮效率表觀調(diào)控機(jī)制和植物耐逆分子機(jī)制方面取得了多項(xiàng)創(chuàng)新性成果，近年來(lái)在Nature Communications、ISME J、Molecular Plant、Plant Cell、Plant Physiology、PLoS Genetics、New Phytologist、Plant Journal等國(guó)際主流雜志發(fā)表了一系列有重要影響力的論文。更多信息請(qǐng)見：http://cpst.hzau.edu.cn/info/1015/1637.htm

寫在后面

為鼓勵(lì)讀者交流、快速解決科研困難，我們建立了“宏基因組”專業(yè)討論群，目前己有國(guó)內(nèi)外5000+ 一線科研人員加入。參與討論，獲得專業(yè)解答，歡迎分享此文至朋友圈，并掃碼加主編好友帶你入群，務(wù)必備注“姓名-單位-研究方向-職稱/年級(jí)”。技術(shù)問題尋求幫助，首先閱讀《如何優(yōu)雅的提問》學(xué)習(xí)解決問題思路，仍未解決群內(nèi)討論，問題不私聊，幫助同行。

學(xué)習(xí)擴(kuò)增子、宏基因組科研思路和分析實(shí)戰(zhàn)，關(guān)注“宏基因組”

點(diǎn)擊閱讀原文，跳轉(zhuǎn)最新文章目錄閱讀
https://mp.weixin.qq.com/s/5jQspEvH5_4Xmart22gjMA

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的ISME：华中农大李霞组发现大豆根际微生物组变化与根瘤菌共生效率的关系的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

如果覺得生活随笔網(wǎng)站內(nèi)容還不錯(cuò)，歡迎將生活随笔推薦給好友。

上一篇：提取TCGA 中体细胞突变数据的表达矩阵
下一篇：圣斗士星矢ol服务器端文件夹,圣斗士星矢