一.文庫類型

轉錄組文庫構建的時候，可以選擇鏈特異性文庫或非鏈特異性文庫。

鏈特異性文庫，我們清楚的知道得到的 reads 跟轉錄本是同向的還是反向的。

鏈特異性文庫構建，有多種方法，最常用的就是基于 dUTP 的方法。

文庫類型有兩種表示方法。

第一種表示法

第二種表示法(PE)

第二種表示法(SE)

建庫方法fr-unstranded

無

無

Standard Illumina

fr-firststrand

RF

R

dUTP, NSR, NNSR

fr-secondstrand

FR

F

Ligation, Standard SOLiD

第一種表示方法：

第二種表示方法：

二.參數設置

在數據分析中，最復雜、最容易出錯、出錯了影響最為嚴重的除了用錯書記，就是搞錯文庫類型參數了。設置錯了可能導致轉錄本很短、表達量極低、比對率極低等。在數據分析的時候，一定要問清楚構建文庫的實驗人員。

常用軟件的參數設置如下。

1. 轉錄本拼接軟件

在進行轉錄本拼接的時候，需要考慮鏈特異性的問題。

1.1 Trinity

非鏈特異性 默認，不需要設置

鏈特異性 參數為：—SS_lib_type ，如果使用dUTP，值為 RF

1.2 cufflinks

非鏈特異性 —library-type fr-unstranded, 默認

鏈特異性 如果使用dUTP：—library-type fr-firststrand

2. 將 reads 比對到基因組的軟件

2.1 tophat

非鏈特異性 —library-type fr-unstranded, 默認

鏈特異性 如果使用dUTP：—library-type fr-firststrand

2.2 hisat2

非鏈特異性 默認，不需要設置

鏈特異性 如果使用dUTP: —rna-strandness RF， 添加了該參數后，每條 reads 將在 sam 文件中出現 XS 的tag，‘+’ ‘-’ 代表該 reads 所在的轉錄本與基因組序列的關系。

2.3 STAR

STAR 的比對中，不需要手動設置文庫類型的參數。

3.表達定量

表達定量軟件根據比對的 sam 文件，計算 read counts，需要提供鏈特異性信息。

3.1 eXpress

非連特異性 默認，不需要設置

鏈特異性 如果使用dUTP：—rf-stranded

3.2 RSEM

RSEM 使用 --strandedness?參數設置 。

非鏈特異性 --strandedness none

鏈特異性 如果使用dUTP: --strandedness reverse

本文來自 基因課，生物信息視頻課程，每周更新。

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總結

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