Digital Spatial Profiler

新一代高維度空間組學技術

摘要：?Digital Spatial Profiler（DSP）是一種專門針對腫瘤免疫和腫瘤微環境設計的空間多靶標技術，該技術在2019年AACR一經推出就受到全球腫瘤學家和腫瘤免疫學家的熱捧。本文通過對“Immunologic alterations in the pancreatic cancer microenvironment of patients treated with neoadjuvant chemotherapy and radiotherapy”和“Biomarkers Associated With Beneficial PD-1 Checkpoint Blockade in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) Identified Using High-Plex Digital Spatial Profiling“兩篇文章的解讀，詳細介紹了DSP技術在腫瘤微環境、生物標志物中的應用。

技術簡介：?2019年， NanoString公司聯合MD安德森等多家研究單位共同開發的一項全新的、基于光學與探針技術的蛋白組學和轉錄組學技術平臺。非因生物成為官方合作伙伴，也是全球8個DSP技術服務中心之一。

應用前景：?DSP技術將表達譜的多重定量信息與組織原位信息進行整合，可在一張石蠟組織切片上實現多達上百種蛋白和上千種mRNA的原位共分析，將組織病理學、腫瘤免疫與表達譜完美結合，在腫瘤微環境研究、腫瘤異質性與腫瘤免疫研究中有著強大的優勢。

研究背景

隨著癌癥免疫治療的蓬勃發展，腫瘤微環境，空間異質性與腫瘤免疫、靶向治療以及傳統放化療的關系越來越受到研究者的關注。癌癥研究也從單純的以腫瘤細胞為核心的方向逐漸過渡到了將傳統靶向治療與免疫相結合的時代，而且深度剖析復雜腫瘤微環境的機制與變化成為了目前癌癥研究和轉化醫學的熱點之一。2012年以后發展起來的單細胞技術(Single-cell RNA-Seq/CyTOF)已從一個較深的層次解析了先前在混雜樣本中發掘不到的信息。然而在癌癥研究中，僅從細胞分群或特殊亞型細胞的鑒定作為生物標志物或指導臨床治療并與預后相關聯仍面臨巨大挑戰。因此如何將細胞的轉錄組學以及蛋白組學信息定位到組織原位則成為一個新的研究方向，而將空間信息與單細胞表達譜信息以及傳統多組學信息更好的結合起來，將成為腫瘤靶向治療未來的發展方向。

從組織原位找尋多組學信息是傳統病理學金標準的研究基礎，然而提高分析靶點通量一直是一個技術瓶頸，也是腫瘤學家、免疫學家以及靶向藥物研發者所關注的熱點。目前大多數關于分子診斷或者生物標志物的臨床應用，往往是基于單一組織活檢，傳統病理金標準可以得到組織形態學和少數標志物表達狀況的信息，但是可分析靶點數目很難從少量的組織樣本中獲得，同時基于病理學家的人為判斷作為評判標準本身就存在局限性。基因測序技術的發展可以實現在混雜組織中測得低豐度的突變信息，然而在表達譜層面，僅有少數癌種可以在一定的技術條件下實現轉錄組層面的分析檢測，其中最為突出的就是乳腺癌術后復發風險評估，如PAM50基因（nanoString），Oncotype DX 21基因，MammaPrint 70基因和EndoPredict 12基因等。在大多數實體瘤中，由于復雜的腫瘤異質性和微環境的互作，很難從大塊組織中獲取到準確的基因表達譜信息，從而導致可能具有重要診斷或預后的生物標志物信息被掩蓋（如圖1）。

圖1 大塊組織無法獲得準確的基因表達譜信息

在腫瘤微環境研究中，我們往往會關注某個亞組織層面上的表達譜信息，諸如比較不同表型病人間腫瘤中心、邊緣、浸潤淋巴細胞及其亞群（腫瘤浸潤淋巴細胞TIL/腫瘤關聯巨噬細胞TAM/三級淋巴結構TLS等）、周邊淋巴細胞、基質、成纖維細胞以及特殊形態學或標志物標記的細胞亞群和它們的相互關系。?非因生物的DSP數據空間分析技術則為這個層面的研究提供了一個強有力的技術支持。它不僅可以在空間層面上實現細分，并可以同時對組織進行轉錄組和蛋白組的共分析，且在蛋白組層面的Multiplexing通量可以達到前所未有的90種之多，包括了當前腫瘤免疫最為火熱的靶點研究，免疫細胞分類，激活水平，檢查點抑制劑，腫瘤凋亡，腫瘤細胞信號等，比現有基于單細胞或多種免疫組化以及循環免疫熒光的技術更有優勢，也更具穩定性。在轉錄組層面，DSP的Cancer Transcriptome Atlas (癌癥轉錄組圖譜)則涵蓋了50多條與腫瘤生物學、免疫、代謝及其它相關的1800多個基因，可以全景分析腫瘤微環境中復雜的生物學機理。不僅如此，DSP還能將臨床樣本的可用性發揮到最大化，可針對石蠟切片（FFPE樣本），組織芯片（TMA）以及新鮮冰凍樣本進行高維度蛋白和RNA的空間分析，更易與其它組學以及臨床信息整合，深度挖掘和探索腫瘤微環境變化的奧秘。該技術作為一項革新性的技術在2019年的AACR年會上剛剛推出就得到業內極大關注，Clinical Cancer Research雜志以封面文章報道了耶魯大學轉化醫學和病理學系主任David Rimm教授運用DSP技術在黑素瘤中的開創性工作，奠定了該技術應用的未來（如圖2）。

圖2

該研究利用組織芯片（TMA），連續運用3個樣本集（cohort）對DSP技術進行了對比驗證，預后標志物驗證和新的生物標志物發掘。Rimm組首先將DSP與QIF（quantitative immunofluorescence AQUA）技術進行比對，得到了DSP與AQUA在不同組織區域的CD3,CD4,CD8,CD20以及PD-L1的表達相關性數據，驗證了該技術的可靠性。然后再通過這兩個技術在非小細胞肺癌（NSCLC）樣本中驗證了已知的CD3標志物在基質區域和腫瘤富集區域與預后的相關性。最后通過對黑素瘤TMA中的44個蛋白指標進行DSP分析，通過三重熒光染色將組織原位對應的巨噬細胞（CD68），淋巴細胞（CD45）以及腫瘤細胞（melanocytes）區域通過masking方式區分開，并進行高精度多重定量。研究者發現了之前在bulk樣本層面或無空間信息支持下所不能發現的新研究結論，PD-L1與CD8的表達在巨噬細胞高表達區域（CD68+富集ROI）與預后存在強相關（PFS/OS），而這兩個蛋白的表達在總淋巴細胞區域（CD45+）則不存在相關性。同理，B2M的表達在CD45富集區域與預后存在強相關性。因此，將腫瘤微環境空間信息與高通量表達譜技術相結合，為生物標志物的探索和開發開辟了新方法和技術路徑。

深度解析

作為癌癥空間組學強有力的研究新技術之一，DSP也逐漸成為了尋找生物標志物的焦點技術。2020年1月，Matthew R. Farren等利用nCounter與DSP技術聯用，尋找免疫生物標志物并發表“Immunologic alterations in the pancreatic cancer microenvironment of patients treated with neoadjuvant chemotherapy and radiotherapy”（如圖3）。

圖3

在該項研究中，研究者以胰腺癌FFPE樣本作為研究對象，針對4種臨床治療策略選取了24例樣本（如圖4），首先利用nCounter表達譜技術探尋不同治療方法間的基因表達差異，再通過生物信息學對基因組富集、蛋白質相互作用富集、分子復合物檢測以及EnrichR分析啟動子進行分析，然后再通過DSP技術分析胰腺癌腫瘤微環境中各種免疫相關蛋白標記物的數量和空間分布的變化。

圖4

研究者首先通過nCounter技術，利用包含770個基因的Pan-Cancer Immune Profiling Panel鑒定出189種差異表達基因（如圖5、圖6）。

圖5

圖6

同時運用DSP分析了樣本里基于腫瘤微環境的各種免疫相關蛋白標記物的數量和空間分布的變化，通過對腫瘤富集區，基質區域，免疫細胞富集區域的分群，分析了210個興趣點（Region of Interest，ROI）中的27個關鍵蛋白表達狀況，ROI包括71 腫瘤區域（24個Surgery Only+ 23個FOLFIRINOX+24個F+SBRT）、70 免疫區域（24個Surgery Only+ 24個FOLFIRINOX+22個F+SBRT ）、69 基質區域（ 22個Surgery Only+ 24個FOLFIRINOX+23個F+SBRT ），如圖7。

圖7

研究發現在腫瘤富集區域，新輔助治療與信號通路、細胞存活通路的改變以及VISTA的表達相關。AKT、β-Catenin、STAT3、Ki-67和BCL2的表達水平在三組樣本中有顯著差異（A）；CD44和VISTA的表達水平在三組樣本中有顯著差異（B）；CD4，CD45，CD56，CD68的表達水平在三組樣本中有顯著差異（C），如圖8。

?圖8

在免疫細胞富集區域，新輔助療法與granzyme B 和PD-L1的高表達相關；F+SBRT與T細胞標記物及抗原刺激的T細胞標記物的低表達相關（如圖9）。在基質區域，信號和檢查點分子的差異（尤其是 PTEN，β-catenin，BCL2和Ki-67 ）與新輔助治療相關；PD-1和VISTA的表達水平在不同組間有顯著差異（如圖10）。該研究充分證明了在生物標志物開發中，我們需要將空間信息納入到分析中去，先前的高通量表達譜技術和低維度的組織原位分析技術都存在這方面的劣勢，而非因生物的DSP技術剛好解決了這一研究瓶頸，為腫瘤微環境研究提供了更多的研究方法和策略。

圖9

圖10

今年4月，David Rimm組用同樣的方法，在Clinical Cancer Research雜志上發表題為“Biomarkers Associated With Beneficial PD-1 Checkpoint Blockade in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) Identified Using High-Plex Digital Spatial Profiling”的研究性文章（如圖11）。該文章沿用了先前黑素瘤的研究策略，運用TMA樣本結合DSP技術發現了在非小細胞肺癌中，免疫細胞富集區域的CD56、CD4表達與預后有關。

圖11

研究者通過在非小細胞肺癌患者樣本中使用DSP技術，對44個腫瘤免疫學高度相關的蛋白進行原位測定，意在開發與預后、免疫治療有效性相關的靶標，然后根據多重免疫熒光及細胞計數數據，采用正交實驗法，對結果進行驗證。

研究人員首先對67個接受了腫瘤免疫療法單一治療的非小細胞肺癌組織進行了熒光染色，根據癌組織（panCK），淋巴細胞（CD45）, 巨噬細胞（CD68）和非淋巴細胞基質細胞的表達對這四個不同區域進行了劃分。（如圖12）

圖12

CD68 [Red](Macrophages)、CD45 [Yellow](all lymphocytes except macrophages)、panCK[Green](Tumor)、Remaining area[Purple]non-immune stroma.

在此形態學指導下，利用DSP技術，對3個不同分組區域的44個蛋白靶標同時進行分析，并與預后信息相結合，一次性篩選出6個與PFS相關的生物標志物，17個與OS相關的生物標志物（如圖13）。

圖13

經多變量分析，空間定位在免疫細胞富集區域篩選出CD56、CD4兩個與兩種預后指標均相關的生物標志物（如圖14）。通過多重免疫熒光及細胞計數等數據的進一步驗證，發現在非腫瘤區域CD56+細胞與基質區域細胞數的比值，與預后指標緊密相關（如圖15）。

圖14

圖15

總結

從以上幾項研究中不難發現，腫瘤的免疫療法正在向著精準化、個體化發展，同時多維度多組學的空間研究也成為發現免疫標志物的重要手段。

總結

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