這篇文章上次發(fā)出后，有朋友留言說到底要測幾個重復(fù)？其實也沒有定論，有錢多多益善。只是需要知道

重復(fù)少時，發(fā)現(xiàn)的差異基因會有不少假陰性，獲得不了結(jié)果時，可嘗試加測一些，可獲得更穩(wěn)定的結(jié)果。

重復(fù)少時，抽樣隨機性大。如下圖隨機抽取2個生物重復(fù)獲得的差異基因數(shù)目最多時是最少時的5倍以上；隨機抽取3個生物重復(fù)獲得的差異基因數(shù)目最多時是最少時的3倍左右。

2016年英國鄧迪大學(xué)的Geoffrey J Barton教授在RNA發(fā)表一篇文章專門評估這一問題。作者對野生型和snf2突變型酵母樣品分別測序了48個生物學(xué)重復(fù)；質(zhì)控后，野生型樣品保留42個生物學(xué)重復(fù)，突變型樣品剩余44個生物學(xué)重復(fù)。

在控制假陽性率為0.05的標(biāo)準(zhǔn)下，用所有可用生物重復(fù)計算出的差異基因定義為該差異基因鑒定工具的金標(biāo)準(zhǔn)差異基因集。

作者評估了11個常用的差異基因分析工具，性能最好的是edgeR,?DESeq2和limma。

下面以edgeR為例展示了不同生物學(xué)重復(fù)數(shù)目對鑒定差異基因的影響。

圖A展示了，在控制相同的假陽性率水平下，不同的生物學(xué)重復(fù)鑒定出的差異基因數(shù)目 (nr: number of biological replicates)。作者從所有生物重復(fù)中隨機抽取2組、3組、4組…生物學(xué)重復(fù)，分別計算差異基因，發(fā)現(xiàn)：

差異基因的數(shù)目整體與生物重復(fù)數(shù)量正相關(guān)。

差異基因數(shù)目的穩(wěn)定性與生物重復(fù)數(shù)量負(fù)相關(guān)；

生物重復(fù)較少時，不同的抽樣導(dǎo)致的差異基因數(shù)目波動較大；

生物重復(fù)較多時，檢測出的差異基因數(shù)目受抽樣影響較小，體現(xiàn)在柱狀圖數(shù)據(jù)分布更集中 (可視化之為什么要使用箱線圖？)。

圖B展示了，不同生物學(xué)重復(fù)與鑒定的差異基因的真陽性率的關(guān)系。不同的實線代表不同的差異基因篩選倍數(shù)變化（T=|Log2(FC)|）條件下的真陽性率。虛線代表假陽性率，近乎一條直線，說明edgeR的假陽性率控制的還是比較好的，比較低，且不受生物重復(fù)數(shù)影響。如果篩選閾值比較高，比如4倍差異（T=2）時，較低的重復(fù)數(shù)即可獲得較高的真陽性率。而篩選閾值較低（T=0）時，真陽性率受生物學(xué)重復(fù)影響較大；生物學(xué)重復(fù)越少，真陽性率越低。常規(guī)篩選標(biāo)準(zhǔn)2倍差異(T=1)時需要20個生物重復(fù)才能達(dá)到與4倍差異相同的真陽性率。

圖C則是圖B的另一種展現(xiàn)，橫軸是篩選倍數(shù)閾值 (T=|Log2(FC)|)。藍(lán)色虛線代表3個生物重復(fù)條件下的假陽性率，在常規(guī)篩選標(biāo)準(zhǔn)2倍差異(T=1)時，假陽性率已趨近于0。不同顏色的實現(xiàn)代表不同生物重復(fù)下的真陽性率隨篩選閾值差異倍數(shù)的變化，整體呈現(xiàn)正相關(guān)；且生物重復(fù)越多，真陽性率越高，并受篩選閾值影響越少。

圖D展示了真陽性、真陰性 (非金標(biāo)準(zhǔn)差異基因定義為真陰性（無差異）基因)、假陽性、假陰性基因數(shù)目隨生物重復(fù)數(shù)的變化。生物重復(fù)越多，漏掉的差異基因（假陰性基因）越少。

原文：https://rnajournal.cshlp.org/content/22/6/839.long

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總結(jié)

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