哈佛大学单细胞课程|笔记汇总 （二）
生物信息學(xué)習(xí)的正確姿勢
NGS系列文章包括NGS基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)錄組分析?（Nature重磅綜述|關(guān)于RNA-seq你想知道的全在這）、ChIP-seq分析?（ChIP-seq基本分析流程）、單細(xì)胞測序分析?(重磅綜述：三萬字長文讀懂單細(xì)胞RNA測序分析的最佳實踐教程 （原理、代碼和評述）)、DNA甲基化分析、重測序分析、GEO數(shù)據(jù)挖掘（典型醫(yī)學(xué)設(shè)計實驗GEO數(shù)據(jù)分析 (step-by-step) - Limma差異分析、火山圖、功能富集）、批次處理等內(nèi)容。
哈佛大學(xué)單細(xì)胞課程|筆記匯總 （一）
（二）Single-cell RNA-seq data - raw data to count matrix
根據(jù)所用文庫制備方法的不同，RNA序列（也被稱為reads或tag）將從轉(zhuǎn)錄本（(10X Genomics, CEL-seq2, Drop-seq, inDrops）的3'端（或5'端）或全長轉(zhuǎn)錄本（Smart-seq）中獲得。
Image credit: Papalexi E and Satija R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity, Nature Reviews Immunology 2018 (https://doi.org/10.1038/nri.2017.76)
不同測序方式的優(yōu)點：
3’（或5’）末端測序：
通過使用UMI進(jìn)行更準(zhǔn)確的定量，從而將生物學(xué)重復(fù)與擴(kuò)增重復(fù)（PCR）區(qū)別開來；
測序的細(xì)胞數(shù)量更多，可以更好地鑒定細(xì)胞類型群；
每個細(xì)胞成本更低；
大于10,000個細(xì)胞的結(jié)果最佳
全長測序：
檢測亞型水平（isoform-level）表達(dá)差異；
鑒定等位基因特異性差異表達(dá)；
對較少數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行更深的測序；
最適用于細(xì)胞數(shù)少的樣品。
我們將主要介紹3’端測序，重點是基于液滴的方法 (inDrops, Drop-seq, 10X Genomics)。
3’-end reads (includes all droplet-based methods)
在3’端測序中，同一轉(zhuǎn)錄本的不同reads片段僅會源自轉(zhuǎn)錄本的3’端，相同序列的可能性很高，同時在建庫過程中的PCR步驟可能導(dǎo)致reads的重復(fù)，因此為了區(qū)分是生物學(xué)還是技術(shù)上的重復(fù)，我們使用唯一標(biāo)識符（unique molecular identifiers，UMI）進(jìn)行標(biāo)注。
比對到相同的轉(zhuǎn)錄本、UMI不同的reads來源于不同的分子，為正常生物轉(zhuǎn)錄，每個read都被計數(shù)。
UMI相同的reads來自同一分子，為技術(shù)重復(fù)，計為1個read。
上面兩條描述是理想情況，方便理解，實際處理起來要復(fù)雜一些。
我們以下圖為例，下圖中分子ACTB的UMI均相同，因此只能記為1個molecule，而ARL1的UMI不同所以可以記為2個molecule。
Image credit: modified from Macosko EZ et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets, Cell 2015 (https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.05.002)_
在細(xì)胞水平進(jìn)行正確定量都需要以下條件：
Sample index: 樣本來源
Added during library preparation - needs to be documented
Cellular barcode: 細(xì)胞來源
Each library preparation method has a stock of cellular barcodes used during the library preparation
Unique molecular identifier (UMI): 轉(zhuǎn)錄本來源
The UMI will be used to collapse PCR duplicates
Sequencing read1: the Read1 sequence
Sequencing read2: the Read2 sequence
例如，使用inDrops v3庫準(zhǔn)備方法時，以下內(nèi)容是reads的所有信息：
Image credit: Sarah Boswell(https://scholar.harvard.edu/saboswell), Director of the Single Cell Sequencing Core at HMS_
R1 (61 bp Read 1): sequence of the read (Red top arrow)
R2 (8 bp Index Read 1 (i7)): cellular barcode - which cell read originated from (Purple top arrow)
R3 (8 bp Index Read 2 (i5)): sample/library index - which sample read originated from (Red bottom arrow)
R4 (14 bp Read 2): read 2 and remaining cellular barcode and UMI - which transcript read originated from (Purple bottom arrow)
對于不同的基于液滴的scRNA-seq方法，scRNA-seq的分析工作流程相似，但是UMI、細(xì)胞ID和樣品索引的解析會有所不同。例如，以下是10X序列reads的示意圖，其中index，UMI和barcode的位置不同 ：
Image credit: Sarah Boswell(https://scholar.harvard.edu/saboswell), Director of the Single Cell Sequencing Core at HMS_
Single-cell RNA-seq workflow
scRNA-seq方法能通過測序的reads解析barcodes和UMI，它們在特定步驟里會輕微地不同，但除了方法外，大致流程都是一致的，常規(guī)工作流程如下所示：
Image credit: Luecken, MD and Theis, FJ. Current best practices in single‐cell RNA‐seq analysis: a tutorial, Mol Syst Biol 2019 (doi: https://doi.org/10.15252/msb.20188746) 中文解讀見：重磅綜述：三萬字長文讀懂單細(xì)胞RNA測序分析的最佳實踐教程 （原理、代碼和評述）
工作流程的步驟是：
生成count矩陣（method-specific steps）：
reads格式化，對樣本進(jìn)行多路分解（demultiplexing，即通過barcodes確定reads的來源），比對和定量。
原始count的質(zhì)量控制：
過濾質(zhì)量較差的細(xì)胞。
細(xì)胞聚類：
基于轉(zhuǎn)錄活性的相似性對細(xì)胞進(jìn)行聚類（細(xì)胞類型數(shù)=簇數(shù)）？
marker識別：
識別每個cluster的標(biāo)記基因。
可選的下游步驟。
無論進(jìn)行那種分析，生物學(xué)重復(fù)都是必要的！
Generation of count matrix
我們聚焦于基于液滴型的3’端測序（比如inDrops、10X Genomics和Drop-seq），將原始測序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為count矩陣。
測序工具將以BCL或FASTQ格式輸出原始測序數(shù)據(jù)，或生成count矩陣。如果reads是BCL格式，我們將需要轉(zhuǎn)換為FASTQ格式。有一個有用的命令行工具bcl2fastq，可以輕松執(zhí)行此轉(zhuǎn)換。
NOTE: We do not demultiplex at this step in the workflow. You may have sequenced 6 samples, but the reads for all samples may be present all in the same BCL or FASTQ file.
對于許多scRNA-seq方法，從原始測序數(shù)據(jù)中生成count矩陣都將經(jīng)歷相似的步驟。
umis（https://github.com/vals/umis）和`zUMIs`（https://github.com/vals/umis）是命令行工具，可用于估計測轉(zhuǎn)錄本3'端的scRNA-seq數(shù)據(jù)的表達(dá)。此過程中的步驟包括：
格式化reads并過濾嘈雜的細(xì)胞barcodes；
Demultiplexing the samples（通過barcodes確定reads的來源）；
比對/偽比對到轉(zhuǎn)錄本；
折疊UMI和定量reads。
當(dāng)然，如果使用10X Genomics建庫方法，Cell Ranger pipeline(https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger)將負(fù)責(zé)執(zhí)行以上的所有步驟 (10X單細(xì)胞測序分析軟件:Cell ranger，從拆庫到定量)。
格式化reads并過濾非細(xì)胞barcodes：
FASTQ文件能解析得到細(xì)胞barcodes、UMIs和樣本barcodes。對于基于液滴型的方法，一些細(xì)胞barcodes會對應(yīng)的低的reads數(shù)(< 1000 reads) ，原因是：
encapsulation of free floating RNA from dying cells
simple cells (RBCs, etc.) expressing few genes
cells that failed for some reason 在比對reads之前，需要從序列數(shù)據(jù)中過濾掉多余的條形碼。
為了進(jìn)行這種過濾，提取并保存每個細(xì)胞的“細(xì)胞條形碼”和“分子條形碼”。
例如，如果使用“umis”工具，則信息將以以下格式添加到每條reads的標(biāo)題行中 (NGS基礎(chǔ) - FASTQ格式解釋和質(zhì)量評估)：
建庫中使用的細(xì)胞條形碼應(yīng)該是已知的，未知的條形碼會被丟棄，同時對于已知的細(xì)胞條形碼允許一定的錯配。
Demultiplexing the samples：
如果測序多于一個樣品執(zhí)行此步驟，這是一步不由“umis”工具處理，而由“zUMIs”完成的步驟，這步會解析reads以確定與每個與細(xì)胞相關(guān)的樣本條形碼。
比對/偽比對到轉(zhuǎn)錄：
通過傳統(tǒng)（STAR）或輕量型（Kallisto/RapMap）方法，將reads比對回基因。
折疊UMI和定量reads：
使用Kallisto或featureCounts之類的工具僅對唯一的UMI進(jìn)行量化，得到
Image credit: extracted from Lafzi et al. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies, Nature Protocols 2018 (https://doi.org/10.1038/s41596-018-0073-y)
矩陣中的每個值代表源自相應(yīng)基因在各個細(xì)胞中的reads數(shù)。
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總結(jié)
以上是生活随笔為你收集整理的哈佛大学单细胞课程|笔记汇总 （二）的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。
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