文章解讀：Tiger

文章校對：生信寶典

研究背景

基質細胞是幾乎每個器官中都存在的定義不明確的非實質成分，在器官發育，體內平衡和修復中起關鍵作用。對骨髓基質的研究已經確定了干細胞生態位中的基質細胞的細胞亞型，其調節造血再生并且能夠引發白血病。在這里，我們使用單細胞RNA測序（scRNA-seq）來定義小鼠骨髓基質的細胞分類和由惡性腫瘤引起的基質變化。我們鑒定了17個表達不同造血調節基因的基質亞群，包括新的成纖維細胞和成骨細胞亞群，構建了不同的成骨細胞分化軌跡。新發的急性髓性白血病損害了間充質成骨分化并導致正常造血所必需的調節分子減少。這些數據表明，組織基質通過干擾正常實質細胞而對惡性細胞發起響應。我們對基質細胞的分類進行了全面解析，也發現了特定基質細胞可以與癌細胞進行互作進而損害正常組織。

研究方案

Sample: 非造血的骨髓細胞，分別取C57BL/6 mice, leukemic mice (造模)（很有趣的是我正文沒有看見細胞數！）

單細胞建庫流程：典型10X Genomics（如下圖）

測序數據分析介紹

工具: Chromium Single Cell 3’ V2 Reagent Kit;

比對: Mouse genome, version mm10；excluded cells with fewer than 500 detected genes;

降維：Seurat package， 表達矩陣→歸一化→挑選高變化表達的基因 （剔除cell-cycle，ribosomal protein,and mitochondrial genes）→PCA分析→使用top 50 (elbow算法) PCA進行細胞分群；

細胞分群和展示：graph cluster+t-SNE;

增殖狀態的評估：作者引用一篇文獻 (Single-cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiation programs upon aging of hematopoietic stem cells. Genome Res. 25, 1860–1872.)中涉及cell-cycle的gene set，計算每個細胞中這些基因的平均表達 (transcripts per 10K transcripts)作為增殖狀態的表示；

GSEA分析；一文掌握GSEA，超詳細教程

隨機森林分類器：訓練隨機森林分類器，預測cluster;

結果分析

(1) 骨髓基質細胞的scRNA-Seq識別六種不同的細胞群及其分化關系;作者對14只C57BL/6小鼠的非造血骨髓細胞進行單細胞測序；分別為：1）多能間充質干細胞 （MSC）（cluster1，表達Lepr）和Cxcl12; 2) 兩個骨系細胞（OLC）亞群（cluster7和8，表達骨鈣素[Bglap]）；3）四個軟骨細胞亞群（cluster2,10,13和17;表達軟骨細胞標記物，聚集蛋白聚糖[Acan]）和Col2a1; 4）5個成纖維細胞亞群（cluster3,5,9,15和16;表達成纖維細胞特異性蛋白-1 [S100a4]）; 5）三個骨髓派生的內皮細胞BMEC子集（cluster0,6和11;表達泛內皮標記Ve-cadherin [Cdh5]）;6）周細胞（cluster12，表達α平滑肌肌動蛋白[Acta2]）; 7）cluster4和8，表達軟骨細胞，成骨細胞和成纖維細胞的標記。流式分選MSC和BMEC，標記BMEC（CD31，Sca-1（Ly6a），CD34，Cdh5）或MSC（CD106）。

(2) Lepr-MSCs通過產生HSC調節因子跨越連續分化狀態并分成細胞亞群；骨髓中MSCs的主流模型是多能干細胞，可分化為骨細胞，脂肪細胞和軟骨細胞，但它們的確切身份仍不清楚。作者將cluster1定義為具有前脂肪細胞特征的Lepr +間充質基質細胞（Lepr-MSC）。作者定義該細胞亞群的重要身份是通過其他細胞的特異性marker在該種細胞的泛表達。在Lepr-MSCs中，作者區分了四個主要子集（LeprMSC-1-4），一個子集（Lepr-MSC-4）具有OLC特異性關鍵功能基因Sp7（osterix）和Alpl的表達，表明其正向成骨細胞進行分化，也支持了Lepr-MSC和OLC-1在分化軌跡方面的連續轉化。

(3) 推斷的譜系關系表明兩個不同分OLC亞群的不同起源和不同的造血支持潛力 (Hematopoietic Support Potential);為了進一步的分析骨系分化，作者將重點放在了Lepr-MSC-4，OLC-1,OLC-2 3個細胞群。三個clusters都可以表達控制MSCs向OLCs分化的重要轉錄因子Runx2；OLC-1,OLC-2 進一步表達Sp7，都是骨譜系分化的重要因子；然后作者發現OLC-1cluster在成骨細胞狀態中存在連續性，并且作者發現在不同時序下gene 表達情況不同；作者在OLC-2 cluster（幾乎均為bone orgin）中觀察到其有3種類型細胞組成，包括骨祖細胞、骨細胞和軟骨細胞；但只有OLC-1細胞表達造血調控因子，說明兩種OLC不同的分化來源和不同的造血潛能。

(4) 后緒作者分別對軟骨細胞，肌成纖維細胞，BMEC和周細胞分別進行了分類；發現肌成纖維細胞和周細胞的某些亞群可以調控造血系統；

(5) 白血病中小鼠骨髓基質細胞比例發生重塑；作者檢測到白血病細胞亞群比例的顯著變化，并且呈現的是一種“coupled effect”，其中（OLC-1增加，OLC-2減少），BMECs（sBMEC減少，cluster6 aBMEC增加），軟骨細胞（cluster2增加，cluster4減少）和成纖維細胞（成纖維細胞-5s減少，成纖維細胞-2s增加）；該種shift與之前的報道是相同的，在白血病患者中可以發生血管重塑，并且損傷骨形成，生長缺陷。

(6) 白血病在Lepr-MSCs和OLCs中損傷了成骨和成脂的分化途徑并且白血病廣泛的損傷了正常造血系統的調控基因的表達；

臨床意義

（1）基質細胞分型可以更清晰，更一致地定義特定基質細胞對體內平衡和異常造血功能的影響，并為血液系統疾病中的基質靶向治療奠定基礎；

（2）為腫瘤進化提供了實驗證據，其中實質和基質元素之間的交叉通信可能影響癌癥的出現。

單細胞文章點評

該篇文章的亮點在于利用單細胞測序技術對骨髓中的stroma進行分類并對其在正常機體和白血病中所發揮的作用進行闡釋；

但是，這篇文章所利用的單細胞的分析方法幾乎是最為簡單的分析流程，并且作者并不強調其測序細胞數的多少（圖例中的細胞數嚇死人），在software中幾乎只用到了seurat和Scanpy；

其實看到這篇文章的第一反應，是我想到了另外一篇文章，***Nature*于2019.05發表的文章《The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.》**該篇文章對骨髓中的成骨細胞，血管細胞等在正常和應激情況下進行比較分析；

同時，我們發現最近有關基質細胞的異質性的單細胞文獻也是比較多的，這可能與先期實驗捕獲有關，上皮細胞的捕獲數量往往沒有基質細胞多，也由于基質細胞幾乎無處不在，作用在傳統意義上有許多的未知；（建議如果你的臟器當中主成分是上皮細胞的話，不要按照流程處理，去看看文獻；如果你做的是全臟器的單細胞圖譜，建議先取胰腺）

我更想說的是，這是一篇標準的單細胞圖譜的構建過程，其實有一點懷疑這篇文章發到***Cell***的亮點在哪里，看來圖譜類的單細胞還沒有做完吧。。。

這篇文章描述的很細致，這也是單細胞文章的特點吧。分析部分分完群后更多的是定制性你選擇關注的信息，進行針對性描述。

自己會分析還是比較關鍵的，不然看到有意義的結果都不能下手去篩選。

參考文獻

Baryawno N, Przybylski D, Kowalczyk MS, Kfoury Y, Severe N, Gustafsson K,Kokkaliaris KD, Mercier F, Tabaka M, Hofree M, Dionne D, Papazian A, Lee D,Ashenberg O, Subramanian A, Vaishnav ED, Rozenblatt-Rosen O, Regev A, Scadden DT.A Cellular Taxonomy of the Bone Marrow Stroma in Homeostasis and Leukemia. Cell. 2019 May 9. pii: S0092-8674(19)30459-3. doi: 10.1016

文末彩蛋

哈哈哈，就是解析**Nature這篇于2019.05發表的文章《The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.》

研究背景

骨髓微環境在調節造血功能中具有關鍵作用，但其分子復雜性和對應激的反應尚未完全了解。作者通過單細胞測序在體內平衡和應激誘導的造血條件下繪制小鼠骨髓血管，血管周圍和成骨細胞群的轉錄圖譜。該分析揭示了骨髓生態位中先前未被認可的細胞異質性水平和解決了造血生長因子、趨化因子和膜結合配體的細胞來源問題。研究表明，在應激條件下，生態位元素的轉錄重塑，包括血管周圍細胞向脂肪細胞發展。在應激誘導的變化中，我們觀察到血管Notch delta樣配體（由Dll1和Dll4編碼）被下調。在沒有血管Dll4的情況下，造血干細胞過早地誘導了髓樣轉錄程序。這些發現改進了我們對骨髓生態位細胞結構的理解，揭示了對應激高度敏感的動態和異質分子圖譜，并說明了單細胞轉錄組數據在評估離散生態亞群對造血功能的調節中的效用。

研究方案

Sample:一共17374個細胞，共構建了三種敲入reporter的小鼠進行標記，VE-Cad–tdTo-mato標記脈管類細胞、LEPR–tdTomato標記LEPR+陽性的細胞、COL2.3–tdTomato 標記成骨細胞 ；

單細胞建庫流程：應用的是SMARTA-seq,建庫流程如下：

測序數據分析介紹

工具:SMART-seq v4 ;

比對?genome (mm10/GRCm38)using STAR alinger;少于1000個gene的細胞，2%離群細胞被剔除；

降維：Seurat package， 先通過CCA對數據進行整合，表達矩陣→歸一化→PCA分析，top40 PCA用于后續分析;

細胞分類和展示：tSNE;

構建細胞發育軌跡：Monocle package;

結果展示

臨床意義

1.將造血因子與其細胞來源相匹配，并顯示血管 - 內皮細胞表達的Notch配體DLL4的缺失使骨髓造血傾向于HSPC的顯著轉錄重編程；

2.靶向生態位相關因子可能干擾疾病的發生和發展;

有興趣的就去讀全文吧！

參考文獻

Tikhonova AN, Dolgalev I, Hu H, Sivaraj KK, Hoxha E, Cuesta-Domínguez á, PinhoS, AkhmetzyanovaI, Gao J, Witkowski M, Guillamot M, Gutkin MC, Zhang Y, MarierC, Diefenbach C, Kousteni S, Heguy A, Zhong H, Fooksman DR, Butler JM, Economides A, Frenette PS, Adams RH, Satija R, Tsirigos A, Aifantis I. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 2019 May;569(7755):222-228.doi: 10.1038

總結

以上是生活随笔為你收集整理的骨髓基质在正常和白血病个体中的细胞图谱|Cell最新（文末有彩蛋）的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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