火山圖是散點(diǎn)圖的一種，它將統(tǒng)計(jì)測(cè)試中的統(tǒng)計(jì)顯著性量度（如p value）和變化幅度相結(jié)合，從而能夠幫助快速直觀地識(shí)別那些變化幅度較大且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)點(diǎn)（基因等）。常應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組研究，也能應(yīng)用于基因組，蛋白質(zhì)組，代謝組等統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

所以關(guān)注火山圖（其它類型圖也是），先理解每個(gè)點(diǎn)是什么（點(diǎn)代表基因、樣品、通路或其它的，這個(gè)認(rèn)識(shí)可以來(lái)自于常識(shí)，更準(zhǔn)確的是看作者的描述），然后看橫軸代表什么、縱軸代表什么，再看圖例中展示的其他信息，如顏色、大小和形狀分別代表什么。這些都理順了，圖理解就不難了。

如圖一：

• 每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)檢測(cè)到的基因。

• 橫軸和縱軸用于固定點(diǎn)在空間的位置。

• 一般橫軸是Log2(fold change)，點(diǎn)越偏離中心，表示差異倍數(shù)越大。

• 縱軸是-Log 10 (adjusted P-value)，點(diǎn)越靠圖的頂部表示差異越顯著。

• 點(diǎn)的大小和顏色也可以表示更多的屬性，如下圖中點(diǎn)的顏色標(biāo)記其對(duì)應(yīng)的基因是上調(diào),?下調(diào)還是無(wú)差異。

  大小也可用于展示基因表達(dá)的平均豐度，一般我們關(guān)注表達(dá)水平較高且差異較大的基因用于后續(xù)的分析和驗(yàn)證。

圖一（圖源：易生信PPT）

火山圖理解常見(jiàn)的幾個(gè)問(wèn)題

但沒(méi)想到，在我們易生信培訓(xùn)過(guò)程中，對(duì)火山圖的問(wèn)題還是比較多的，我們一個(gè)個(gè)的說(shuō)一下。

什么是**fold change?**

翻譯成中文是差異倍數(shù)，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是基因在一組樣品中的表達(dá)值的均值除以其在另一組樣品中的表達(dá)值的均值。所以火山圖只適合展示兩組樣品之間的比較。

為什么要做**Log 2轉(zhuǎn)換？**

兩個(gè)數(shù)相除獲得的結(jié)果 （fold change）要么大于1，要么小于1，要么等于1。這是一句正確的廢話吧？那么對(duì)應(yīng)于基因差異呢？簡(jiǎn)單說(shuō)，大于1表示上調(diào)（可以描述為上調(diào)多少倍），小于1表示下調(diào)（可以描述為下調(diào)為原來(lái)的多少分之多少）。大于1可以到多大呢？多大都有可能。小于1可以到多小呢？最小到0。用原始的fold change描述上調(diào)方便，描述下調(diào)不方便。繪制到圖中時(shí)，上調(diào)占的空間多，下調(diào)占的空間少，展示起來(lái)不方便。所以一般會(huì)做Log 2轉(zhuǎn)換。默認(rèn)我們都會(huì)用兩倍差異 （fold change == 2 | 0.5）做為一個(gè)篩選標(biāo)準(zhǔn)。Log2轉(zhuǎn)換的優(yōu)勢(shì)就體現(xiàn)出來(lái)了，上調(diào)的基因轉(zhuǎn)換后Log2 (fold change)都大于等于1，下調(diào)的基因轉(zhuǎn)換后Log2 (fold change)都小于等于-1。無(wú)論是展示還是描述是不是都更方便了。

**P-value**都比較熟悉，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)獲得的是否統(tǒng)計(jì)差異顯著的一個(gè)衡量值，約定成俗的P-value<0.05為統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯著的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。

什么是**adjusted P-value?**

這里面就涉及到一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)問(wèn)題了。做差異基因檢測(cè)時(shí)，要對(duì)成千上萬(wàn)的基因分別做差異統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)家認(rèn)為做這么多次的檢驗(yàn)，本身就會(huì)引入假陽(yáng)性結(jié)果，需要做一個(gè)多重假設(shè)檢驗(yàn)校正。

這個(gè)校正怎么做呢？最簡(jiǎn)單粗暴的方法是每一次統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)獲得的P-value都乘以總的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的次數(shù)獲得adjusted P-value?(這就是Bonferroni correction）。

但這樣操作太嚴(yán)苛了，很容易降低統(tǒng)計(jì)檢出力，找不到有差異的基因。后續(xù)又有統(tǒng)計(jì)學(xué)家提出相對(duì)不這么嚴(yán)苛的計(jì)算方法，如holm,?hochberg,?hommel,?BH,?BY,?fdr等。BH是我們比較常用的一個(gè)校正方法，獲得的值是假陽(yáng)性率 FDR?（false discovery rate）。

FDR篩選時(shí)就可以不用遵循0.05這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)了。我們可以設(shè)置FDR<0.05表示我們?nèi)菰S數(shù)據(jù)中存在至多5%假陽(yáng)性率；FDR<0.1表示我們對(duì)假陽(yáng)性率的容忍度至多是10%。當(dāng)然如果說(shuō)我們?cè)O(shè)置FDR<0.5，即數(shù)據(jù)中最多可能有一半是假陽(yáng)性就說(shuō)不過(guò)去了。

同樣為什么做**-Log 10轉(zhuǎn)換呢？**

因?yàn)镕DR值是0-1之間，數(shù)值越小越是統(tǒng)計(jì)顯著，也越是我們關(guān)注的。-Log 10 (adjusted P-value)轉(zhuǎn)換后正好是反了多來(lái)，數(shù)值越大越顯著，而且以10為底很容易換算回去。

理解完這些之后，再來(lái)看火山圖。

• 整體來(lái)看，基因有上調(diào)就有下調(diào)，圖整體是以X=0的垂線左右對(duì)稱的。如果數(shù)據(jù)中大部分點(diǎn)都是上調(diào)或下調(diào)，成偏態(tài)分布時(shí)，需考慮標(biāo)準(zhǔn)化步驟沒(méi)有處理好，或數(shù)據(jù)存在批次效應(yīng)，導(dǎo)致數(shù)據(jù)存在系統(tǒng)偏差。

• 圖的左上角和右上角是差異基因集中的地方，也是我們關(guān)注的重點(diǎn)。

• 圖一中左側(cè)的火山圖還展示了基因表達(dá)的平均豐度，即基因在所有樣品中表達(dá)的均值。一般變化倍數(shù)大、平均表達(dá)也比較高的基因會(huì)更可信，更適合后期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，否則就算變化倍數(shù)再大，表達(dá)低的基因也難以被檢測(cè)到。

番外：

差異倍數(shù)fold change還有另外一種處理方式。假如有兩個(gè)樣品A和B。如果某個(gè)基因在A中表達(dá)比較高，則計(jì)算fold change是用A/B; 。如果某個(gè)基因在B中表達(dá)比較高，則計(jì)算fold change是用B/A，然后乘以-1;?gtools::foldchange是這么操作的。

adjusted P-value,?q value,?fdr一般代表相同的含義，都是多重假設(shè)檢驗(yàn)校正后的P-value,可能的區(qū)別就在于校正算法的不同。

幾個(gè)代表性火山圖

火山圖雖然用的多，但其實(shí)能提供的信息算不上多，一般是在上面標(biāo)記一些關(guān)注的基因的名字，然后在正文中做下描述。標(biāo)記基因名字的方式也比較多，圖二中左圖的顏色標(biāo)示是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

圖二（圖源：易生信PPT）

圖二右圖來(lái)自2017年發(fā)表在Cell的一篇文章-Epigenetic Therapy Ties MYC Depletion to Reversing Immune Evasion and Treating Lung Cancer。

• https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867417312448

一排火山圖放在一起是不是很有氣勢(shì)，更主要的是展示了5種疫苗誘導(dǎo)的差異基因數(shù)目顯著不同，在圖上紅點(diǎn)多少展示出的視覺(jué)沖擊還是優(yōu)于圖標(biāo)中的數(shù)字表示的，更容易留下直觀的印象。個(gè)人覺(jué)得是一個(gè)很有特色的火山圖案例。

圖三

圖三來(lái)自文章Edwards, J., et al. (2015). PNAS Fig. 2A。

• http://www.pnas.org/content/112/8/E911.short

這是一篇16S分析文章較系統(tǒng)的作品，兩年被引用147次，推薦閱讀。上面的火山圖展示了水稻根不同生態(tài)位相對(duì)于土壤中顯著差異的OTU，橫坐標(biāo)是相對(duì)豐度平均值（Log10?轉(zhuǎn)換），縱坐標(biāo)是Log10(fold change)，整體類似于圖一中的左圖，只是轉(zhuǎn)換了X和Y軸變量。

圖四

火山圖就是散點(diǎn)圖，點(diǎn)的顏色可展示代表性屬性。

圖四來(lái)源—?https://arxiv.org/pdf/1103.3434.pdf?：

第6號(hào)染色體上的探針/基因用紅色標(biāo)記，在基因注釋中帶有“細(xì)胞因子”的探針/基因用藍(lán)色標(biāo)記。

增強(qiáng)火山圖之在基本火山圖的基礎(chǔ)上，標(biāo)注有變量-基因名。

上圖共有64102個(gè)變量，綠色的點(diǎn)的|log2FC|>1，藍(lán)色的點(diǎn)是P value <0.0001。紅色的點(diǎn)是滿足了以上兩點(diǎn)要求的變量。

如有雷同數(shù)據(jù)，可大膽參照模仿，更多增強(qiáng)火山圖見(jiàn)：
傳送門(mén)（代碼）??

• 增強(qiáng)火山圖，要不要試一下？

火山圖繪制

最簡(jiǎn)單的繪制方法是使用我們的在線網(wǎng)站——imageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的Volcano plot | 别再问我这为什么是火山图的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

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