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大規(guī)模并行測(cè)序技術(shù)為表觀基因組學(xué)領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。本文描繪了用于表觀基因組分析的關(guān)鍵方法，包括（1）亞硫酸鹽測(cè)序，（2）染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-Seq），（3）測(cè)定開(kāi)放染色質(zhì)，和（4）基因組3D構(gòu)象捕獲。

亞硫酸鹽測(cè)序

全基因組DNA甲基化可以通過(guò)基于抗體富集的方法和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA測(cè)序?qū)崿F(xiàn)。基于富集的方法可以定性檢測(cè)甲基化修飾區(qū)域，能夠區(qū)分5mC和5hmC，并且可以與結(jié)合酶切提高分辨率和敏感性。基于抗體富集的方法需要每個(gè)樣品測(cè)序50-100 M 短序列。

亞硫酸鹽處理的DNA直接測(cè)序可以定量DNA甲基化修飾水平，但不能區(qū)分5mC和5hmC。亞硫酸鹽測(cè)序有兩個(gè)主要的文庫(kù)構(gòu)建的策略。在第一種方法（示出）中，加入連接子的基因組文庫(kù)進(jìn)行亞硫酸鹽處理（Lister等人，2009）。在第二種中（未顯示），基因組DNA首先進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，然后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建（Miura等，2012）。對(duì)于轉(zhuǎn)換方法，為每個(gè)樣品產(chǎn)生10億個(gè)100nt序列讀數(shù)，并且文庫(kù)構(gòu)建方法在基因組覆蓋中引入不同的文庫(kù)偏好。

DNA甲基化分析
胞嘧啶修飾是哺乳動(dòng)物基因組的一個(gè)特點(diǎn)。

全基因組水平的5-甲基-胞嘧啶修飾（5mC，又稱DNA甲基化）及其氧化衍生物（例如5hmC）圖譜繪制通常使用基于富集和轉(zhuǎn)化的方法結(jié)合大規(guī)模并行測(cè)序來(lái)實(shí)現(xiàn)。亞硫酸鹽處理可以定量5mC修飾圖譜，但不能區(qū)分5hmC。抗體富集可以對(duì)5mC和5hmC進(jìn)行定性測(cè)量。將亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化或抗體富集的DNA純化，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并克隆測(cè)序。后期需要特定的算法和工具進(jìn)行序列比對(duì)和甲基化水平計(jì)算。

染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序
組蛋白化學(xué)修飾。

全基因組水平的組蛋白修飾通常使用染色質(zhì)免疫沉淀偶聯(lián)大規(guī)模并行測(cè)序（ChIP-seq）來(lái)實(shí)現(xiàn)。 組蛋白結(jié)合的DNA可以通過(guò)超聲處理、酶消化或轉(zhuǎn)座子插入的方式（未顯示）從基因組中釋放。如果使用超聲處理，染色質(zhì)必須首先進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)（見(jiàn)步驟4）。組蛋白解離后，特定的化學(xué)修飾通過(guò)免疫結(jié)合富集。富集后的復(fù)合體進(jìn)行DNA純化，文庫(kù)構(gòu)建，大規(guī)模測(cè)序，并進(jìn)行生信分析。
3. 開(kāi)放染色質(zhì)分析
核小體耗盡的區(qū)域富含調(diào)節(jié)元件。
全基因組水平的開(kāi)放染色質(zhì)分析通常通過(guò)DNA片段集合的大規(guī)模并行測(cè)序?qū)崿F(xiàn)，此片段集合可從經(jīng)轉(zhuǎn)座子插入、酶促消化或超聲處理的完整染色質(zhì)中釋放得到。選取所得DNA片段大小或苯酚-氯仿提取之，以耗盡核小體結(jié)合的DNA。富集后的復(fù)合體進(jìn)行DNA純化，文庫(kù)構(gòu)建，大規(guī)模測(cè)序，并進(jìn)行生信分析。

3D染色質(zhì)捕獲
染色質(zhì)環(huán)接觸揭示遠(yuǎn)端調(diào)控元件和結(jié)構(gòu)域。
全基因組水平的長(zhǎng)范圍染色質(zhì)接觸是通過(guò)鄰近連接產(chǎn)生的DNA片段集合的大量并行測(cè)序?qū)崿F(xiàn)的。完整的染色質(zhì)以物理連接與三維空間相鄰的基因組遠(yuǎn)端核小體相交聯(lián)。

交聯(lián)的染色質(zhì)被酶促消化，所得的DNA用生物素標(biāo)記末端并進(jìn)行鄰近連接。連接的DNA通過(guò)超聲處理或酶消化被剪切，而連接點(diǎn)通過(guò)鏈霉親和素下拉富集。純化得到的DNA，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、大規(guī)模測(cè)序及生信分析。

SnapShot：Epigenomic Assays

染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序
全基因組水平的組蛋白修飾通過(guò)ChIP-seq檢測(cè)到了（Barski等，2007）。通常，對(duì)25-50萬(wàn)個(gè)免疫沉淀片段進(jìn)行組蛋白標(biāo)記的測(cè)序。顯示了從與100-300bp基因組片段相關(guān)的染色質(zhì)釋放核小體的兩種主要策略。此外，利用基于轉(zhuǎn)座子的染色質(zhì)片段的策略近來(lái)已經(jīng)適用（Schmidl等，2015）。
繪制開(kāi)放的染色質(zhì)
開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域的基因組位置通過(guò)直接測(cè)序從經(jīng)轉(zhuǎn)座子插入（Buenrostro等，2013）或酶消化（Boyle等，2008; Crawford等，2006）的染色質(zhì)中釋放的基因組DNA片段來(lái)測(cè)量。該方案的變體（未顯示）化學(xué)性交聯(lián)染色質(zhì)并使用超聲處理隨后釋放通過(guò)苯酚 - 氯仿萃取富集的非交聯(lián)區(qū)域（Boyle等人，2008）。測(cè)序要求取決于實(shí)驗(yàn)參數(shù)和分辨率要求，范圍為從每個(gè)樣品10到100多百萬(wàn)個(gè)片段。
染色體構(gòu)象捕獲
染色體構(gòu)象捕獲（3C）技術(shù)提供了DNA片段在三維（3D）空間的基礎(chǔ)上相互作用的位置（Bonev和Cavalli，2016）。為了測(cè)量全基因組水平的染色質(zhì)相互作用，單個(gè)實(shí)驗(yàn)通常需要5億個(gè)序列讀數(shù)。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的表观基因组分析的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

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