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Abstract

In vertebrates, multipotent progenitors located in the pharyngeal mesoderm form cardiomyocytes and branchiomeric head muscles, but the dynamic gene expression programmes and mechanisms underlying cardiopharyngeal multipotency and heart versus head muscle fate choices remain elusive. Here, we used single-cell genomics in the simple chordate model?Ciona?to reconstruct developmental trajectories forming first and second heart lineages and pharyngeal muscle precursors and characterize the molecular underpinnings of cardiopharyngeal fate choices. We show that FGF–MAPK signalling maintains multipotency and promotes the pharyngeal muscle fate, whereas signal termination permits the deployment of a pan-cardiac programme, shared by the first and second heart lineages, to define heart identity. In the second heart lineage, a?Tbx1/10-Dach?pathway actively suppresses the first heart lineage programme, conditioning later cell diversity in the beating heart. Finally, cross-species comparisons between?Ciona?and the mouse evoke the deep evolutionary origins of cardiopharyngeal networks in chordates.

研究背景

在脊椎動物中，位于咽中胚層的多能祖細胞形成心肌細胞和分枝狀頭部肌肉，但心咽部的多能性以及心臟與頭部肌肉發育選擇中基因程序的動態表達和機制仍然未知。作者在簡單的脊索動物模型Ciona中使用單細胞基因組學來重建形成第一和第二心臟譜系以及咽部肌肉前體的發育軌跡，并且識別心咽發育選擇的分子基礎。研究顯示FGF-MAPK信號傳導可以維持多能性并促進咽部肌肉發育，而信號終止則會啟動由第一和第二心臟譜系構成的泛心臟程序來定義心臟身份。在第二個心臟譜系中，Tbx1 / 10-Dach途徑主動抑制第一個心臟譜系程序，調節跳動心臟中的后期細胞多樣性。最后，Ciona和小鼠之間的跨物種比較暗示了脊索動物心咽網絡的深層進化起源。

研究方案

sample: 848 high-quality single-cell transcriptomes ,five time points ;

單細胞建庫流程：Smart-seq2（10X單細胞測序分析軟件:Cell ranger，從拆庫到定量）

測序數據分析介紹

Bulk RNA-seq

工具:SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit ;

比對:C.robustae C. robusta genome (joined scaffold (KH), http://ghost.zool.kyoto-u.ac.jp/datas/JoinedScaffold.zip) using?TopHat 2.0.12?with parameter?–no-coverage-search?;

基因差異分析：edgeR;

single cell RNA seq

工具:modified Smart-seq2 protocol ;

比對:與Bulk組相同，都是C.robustae C. robusta genome；

篩選：選擇的單細胞有多于2000且少于6000的表達基因，表達基因在不少于三種細胞中可檢測到；

Batch effects的去除：在用所有的genes進行PCA分析時，作者發現PC2,PC5,PC7都是核糖體基因或者未注釋的genes，作者通過一種算法將這些PCs都進行了去除；(注：這個算法挺有意思，應該看一下)

Clustering and Find.Markers：t-SNE,Seurat’s ‘find.markers’ function with parameters test.use=‘roc’, thresh.use=1 and min.pct=0.5 ;

時序分析：通過得到前兩個比對成分（注：這里說的前2個比對成分，應該就是PC1-2）的主曲線實現每個細胞的偽時間比對，每個細胞中單位速度的弧長參數確定偽時間，范圍在[0，1]之間；

TVC（軀干腹側細胞），STVC（第二軀干腹側細胞），ASM(心房虹吸肌)，FHP和SHP(第一和第二心臟前體細胞)

結果分析

（1）早期心咽譜系的單細胞轉錄組圖譜。為了從多能祖細胞轉變為不同發育前體細胞的過程中識別基因的表達變化，作者通過流式細胞分選（FACS）從同步發育的胚胎和幼蟲中純化得到心咽系細胞，利用Smart-seq2技術進行了基于平板的單細胞RNA測序（scRNA-seq）。作者在五個時間點獲得了848個單細胞轉錄組，涵蓋了早期的心咽發育階段（圖a）。通過對從孵化后幼蟲分離的fate-restricted細胞進行單細胞測序，鑒定出了Gata4 / 5/6 +第一和第二心臟前體細胞（FHP和SHP）以及Ebf +心房虹吸肌（ASM）前體細胞。差異表達分析鑒定 ①ASM/咽肌vs泛心臟特異性標志物②FHPvsSHP特異性標志物(圖b)。top111個預測的泛心臟基因中包括心臟特異性genes，包括Gata4 / 5/6，Nk4 / Nkx2-5和Hand，作者通過熒光原位雜交（FISH）確認19種候選標記物的心臟特異性表達，包括Meis和Lrp4 / 8(圖d)。泛心臟與咽部肌肉對比度主導晚期細胞異質性，但是FHP和SHP群體依然分離(圖b)。因此，作者的分析揭示了在發育過程中祖細胞被激活的特定程序，包括共同（’泛心臟’）和心臟前體的第一vs第二心臟譜系的特異性印記。

（2）為了表征基因表達的動態變化，作者對不同時間點的單細胞轉錄組進行了偽時序分析，作者確定了多能祖細胞和分離的心臟和咽部肌肉分支。然而，這種無監督分析未能正確區分第一和第二心臟譜系，可能是因為共享的泛心臟genes主導了譜系特異性特征。利用不變的譜系并組合了與每個分支相對應的細胞，作者創建了第一和第二心臟以及咽肌譜系的三條單向軌跡(圖a,b)。細胞沿偽時軸的分布對應于起源時間，發育軌跡表明基因表達逐漸變化的持續過程。然而，后期在偽時間軸中變化的gene與突然的生物轉變terms等一致，例如細胞分裂。為了識別這種“開關式”的不連續性發育，作者利用細胞之間的相關性進行層次聚類，在心臟咽部軌跡上確定了10個假設的離散調節狀態，包括兩個多能狀態，以及八個連續向特定發育方向的轉換(圖d)。

（3）作者進一步探索了調控狀態進展的分子基礎。作者首先關注咽部肌肉軌跡，從圖1a中得知其中關鍵調節因子為Hand-r，Tbx1 / 10和Ebf。前兩個調節狀態對應于多能心咽祖細胞的連續生成（TVC和第二軀干腹側細胞，STVC），為證實不對稱細胞分裂作為第一次轉變提供了生物學基礎。盡管來自16hpf幼蟲的新生咽肌前體細胞都表達了Ebf，但這些細胞與從14hpf胚胎中分離出的多能祖細胞聚在一起。這表明，盡管新生的咽肌祖細胞已經表達了一個關鍵的決定基因，但它們的轉錄組仍然與它們的多能母細胞相似。實際上，當細胞發生連續狀態的轉變時，咽肌轉錄組逐漸重塑，包括引發的心臟標志物的表達量下調和咽肌標志物的從頭活化。此外，與Ebf功能的擾動后的表達譜的系統比較表明，包括肌原性調節因子（Mrf）（MyoD / Myf5同源物）和肌球蛋白重鏈3（Mhc3）等在內的候選Ebf靶基因，是在較晚的時期被激活，與轉變為定型咽部肌肉狀態過程中對Ebf的依賴性一致(圖a-f)。

（4）成纖維細胞生長因子（FGF）-MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號傳導的終止啟動了心臟形成的泛心臟程序：接下來，作者研究了心臟形成期間狀態轉換的基因表達變化；作者聚焦于第一個心臟軌跡，其表征泛心臟程序的偽時序范圍最廣。從泛心臟標志物的激活和最初的咽部肌肉以及多能特異性標志物的下調解釋了大多數基因表達變化(圖a)。這些協調的基因表達變化解釋了沿心臟軌跡的主要轉變。例如，作者使用邏輯回歸來確定Slit1 / 2/3在多能和FHP1狀態之間的轉換處被激活，并且通過FISH確認。研究人員使用每個基因的PC1來估計每個gene對離散調節狀態的contribution(圖c)。這表明多能狀態主要由TVC特異性基因和引發的心臟和咽部肌肉標記物的組合表達決定。TVC到FHP1的轉變以TVC特異性基因表達的急劇下降為特征，伴隨著引發的ASM基因的下調，引發的泛心臟基因的上調和從頭表達的泛心臟基因的激活。在這方面，FHP1狀態可以被認為是多能TVC狀態和FHP2狀態之間的“過渡狀態”。真正的泛心臟程序應該在第一和第二心臟譜系中表現出相似的動態變化，反映了共同的調控邏輯。值得注意的是，每個基因的表達始終在第二個心臟軌跡中延遲，從STVC到SHP1轉變開始，因為SHP出生于第二代多能祖細胞，比FHP晚約2小時。然后，作者探究了在心臟譜系中觸發泛心臟程序的調控開關，研究分析表明，心臟譜系特異性終止FGF-MAPK信號傳導允許激活從頭表達的泛心臟基因和隨后的心臟分化的特異性，而心咽祖細胞中的FGF-MAPK信號傳導通過維持引發的咽部肌肉發育程序或抑制心臟特異化編程來促進多能性。

（5）心臟譜系之間的差異促進具有跳動功能的心臟細胞多樣性：相同的泛心臟基因可以定義心臟身份，但不同的前體細胞分別聚集在一起，揭示了第一和第二心臟譜系之間的顯著差異。由于海鞘和脊椎動物的第二心臟區域具有相同來自Nk4 / Nkx2-5和Tbx1 / 10直向同源物的調節，作者探索了第二心臟軌跡以研究脊椎動物第二心臟區的發育和進化。通過利用（CRISPR）/ Cas9使部分基因功能喪失后發現Dach既是marker又是形成第二心臟譜系的關鍵調節因子，是防止第一個心臟譜系特異性標記物Mmp21活化的必需條件。Tbx1 / 10功能喪失抑制Dach表達，并引起Mmp21的異位激活，表明Tbx1 / 10促進第二心臟譜系的特異性，部分通過調節Dach激活的作用產生。實際上，Tbx1 / 10與FGF-MAPK平行激活Ebf并促進咽部肌肉程序，其方式類似于脊椎動物分支單體肌生成中的Tbx1功能。為了探索區分Tbx1 / 10雙重功能的機制，作者使用MAP激酶激酶（MEK）抑制劑U0126，其抑制Ebf表達，并在通常形成Ebf +咽肌前體的外側大多數心咽組織細胞中引起異位Dach活化。此外，Tbx1 / 10 錯位表達和MEK抑制協同作用，在心咽祖細胞中引起早熟和異位Dach活化。總之，這些數據表明在Tbx1 / 10 +心咽祖細胞中終止FGF-MAPK信號傳導足以激活Dach表達并促進第二心臟譜系形成，并證明了與Tbx1 / 10一致的不同信號環境如何促進不同的調節程序。

（6）脊索動物中保守的心咽轉錄特征。最近有文獻報道對小鼠早期中胚層譜系的scRNA-seq分析鑒定了由高水平的Tbx1和Dach1表達標記的咽中胚層細胞群體。多色免疫組織化學染色顯示Dach1表達在咽中胚層中廣泛開始，并且限于背側心包壁中的第二心臟細胞。使用已發表的scRNA-seq數據集擴展了心咽轉錄組的Ciona-to-mouse比較。我們使用典型相關分析（CCA）來鑒定在Ciona和E8.25小鼠胚胎中分離心臟和咽中胚層細胞的基因。然后，作者使用30個最佳相關基因獨立地重新分離來自每個物種的scRNA-seq數據，并發現這些標記足以區分任一物種中的心臟和咽部肌肉細胞，從而揭示共享的轉錄程序 。總的來說，這個分析表明，進化上保守的轉錄程序，包括Ebf1，Gata4等的同源物調節基因，控制心臟與咽部肌肉的在心咽中胚層中的發育選擇。

單細胞文章點評

該篇文章個人認為不再是傳統意義上的圖譜類或發育類文章，該篇文章對大量生物學內容尤其是在心咽發育過程中分子調節之間的轉換的理解，真的叫人拍手打call!

單細胞技術只是技術，和其他測序技術一樣也會過時，錦上添花的固然好，關鍵還是在專業領域要真正的“專業”！

想到了另一篇文章，也是做心臟發育的一篇，于2019年1月發表在***Cell Report***上的***《Single-Cell Transcriptome Analysis Maps the Developmental Track of the Human Heart》***，對心臟發育感興趣的小伙伴可以看一下啊。

其實每一次看文章我都是抱著看看他們有木有什么新的R包可以借鑒或者是他們的代碼公開后我可以進行一下原文的復現，但發現多數是以失敗告終的，尤其是一些要是不看那篇文章根本不知道有這回事的包，所以不要總去想著去“秀包”。。。

沒事多去看看說明文檔吧，尤其是Seurat v3?的說明文檔，里面增加了好多的新功能，尤其是在用于組之間比對分析時。

參考文獻

`Wang W, Niu X, Stuart T, Jullian E, Mauck WM 3rd, Kelly RG, Satija R,Christiaen L. A single-cell transcriptional roadmap for cardiopharyngeal fate diversification. Nat Cell Biol. 2019 Jun;21(6):674-686\. doi: 10.1038`

總結

以上是生活随笔為你收集整理的NCB|心咽发育多样化的单细胞转录轨迹分析的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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