miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控是否真正的存在，最常用的方法就是熒光素酶報(bào)告基因。

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熒光素酶

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熒光素酶（luciferase，Luc）是指能催化不同底物（如熒光素、腔腸素等）發(fā)生氧化使其發(fā)射出熒光的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，在許多昆蟲(chóng)、海洋生物和原核生物中均能分離得到。目前最常用的熒光素酶有細(xì)菌熒光素酶（bacterial luciferase，BL）和螢火蟲(chóng)熒光素酶（firefly luciferase，FL）兩大類(lèi)。細(xì)菌熒光素酶是一種具有熱不穩(wěn)定性的異源蛋白二聚體，含有α、β 兩個(gè)多肽亞基的加單氧酶，它能催化長(zhǎng)鏈脂肪醛、還原性黃素（FMNH2）和O2的氧化反應(yīng)，發(fā)出藍(lán)綠光（λ=490 nm）。螢火蟲(chóng)熒光素酶由單一多肽鏈組成，在Mg2+、ATP、O2 存在時(shí)，催化D-熒光素（D-Luciferin）氧化脫羧發(fā)光（λ=550~580 nm），FL 的檢測(cè)線(xiàn)性范圍寬達(dá)7～8 個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10的-19次方mol（比CAT 高100倍），現(xiàn)已成為哺乳細(xì)胞中的最常使用的報(bào)告基因。高靈敏度、多用途、半衰期短、背景極低和相對(duì)簡(jiǎn)單的分析方法是螢火蟲(chóng)熒光蛋白流行使用的主要原因。常用的檢測(cè)熒光素酶的方法有液閃法和光照度計(jì)法。隨著具有膜透過(guò)性和光裂解作用的螢火蟲(chóng)熒光素酶的發(fā)現(xiàn)和使用，無(wú)需裂解細(xì)胞即可檢測(cè)酶的活性。

熒光素酶普遍具有靈敏度高、檢測(cè)快速、方便等特點(diǎn)。熒光素酶通過(guò)載體構(gòu)建可以研究基因組織的特異性表達(dá)；對(duì)一些細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估；在驗(yàn)證miRNA 靶基因中熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)則是目前的常用方法；有些情況如用逆轉(zhuǎn)錄酶病毒構(gòu)建的方法在較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)中則發(fā)現(xiàn)表達(dá)熒光素酶的能力下降。熒光素酶能與蛋白產(chǎn)生融合，可以構(gòu)建雙報(bào)告基因的表達(dá)系統(tǒng)，如海腎熒光素酶與紅色熒光蛋白、螢火蟲(chóng)熒光素酶與綠色熒光蛋白以及螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶等雙表達(dá)系統(tǒng)。目前這類(lèi)報(bào)告基因發(fā)展迅速、應(yīng)用領(lǐng)域日趨廣泛。

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海腎熒光素酶基因（renilla luciferase，Rluc）是一種新型的熒光素酶報(bào)告基因，近年來(lái)發(fā)展迅速。該基因的cDNA 是從海洋中的珊瑚蟲(chóng)類(lèi)腔腸動(dòng)物海腎中克隆而來(lái)，然后與pRL 載體相連構(gòu)建而成。Rluc 表達(dá)的蛋白是一種36 kD的單體酶（RLUC），能夠催化可穿透細(xì)胞膜的腸腔酶氧化并發(fā)出熒光，酶在與其底物相互作用后，隨著螢光素的氧化而發(fā)出熒光，并且反應(yīng)效率很高，幾乎所有輸入反應(yīng)的能量都被轉(zhuǎn)化為光。還有研究認(rèn)為，接觸反應(yīng)基團(tuán)與熒光生成的去碳酸基反應(yīng)直接相關(guān)，其他活性產(chǎn)物可用于底物的結(jié)合。在活細(xì)胞內(nèi)，Rluc 表達(dá)產(chǎn)物還能作為Ca2+的熒光指示劑。

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總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的miRNA实验与荧光素酶的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

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